CRISPR篩選技術(shù)幫你高效率發(fā)現(xiàn)目的基因

zhongguorui 2017-07-29

展開全文

CRISPR 技術(shù)自從誕生以來，正在迅速催化生命科學(xué)研究，精準(zhǔn)的基因組編輯功能已經(jīng)成為很多實驗室的常規(guī)工具。CRISPR/Cas9技術(shù)（Clustered Regularly Interspace Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated nuclease 9），和常規(guī)的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)更易操作，效率更高，細(xì)胞毒性更低，脫靶效應(yīng)較少，其在癌癥研究、構(gòu)建動物腫瘤模型、篩選抗腫瘤或致腫瘤基因、癌癥的基因治療方面潛力巨大，其中CRISPR篩選技術(shù)更是越來越多被功能基因組學(xué)科學(xué)家所青睞。

(一) 功能基因組學(xué)中的基因編輯技術(shù)

基因組的研究能讓我們對生命更加地了解，如此繁多的基因，表觀遺傳學(xué)的印記，調(diào)控元件以及拓補異構(gòu)域在如何決定整個細(xì)胞的功能方面，知之甚少。功能基因組學(xué)（Functional genomics）運用遺傳學(xué)原理，通過識別、改造某個基因在一個或多個生物模型中的作用來認(rèn)識新發(fā)現(xiàn)基因的功能。其中基因打靶技術(shù)（knockin、knockout、deletion等）非常重要，其通過同源重組、干細(xì)胞技術(shù)對基因進行改造，使得功能基因組學(xué)取得了長足的發(fā)展。

1) RNAi技術(shù)：可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，屬于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，作用于RNA水平，但其缺點是脫靶效應(yīng)嚴(yán)重，阻礙了其作為大規(guī)?；蚬δ芎Y選技術(shù)。

2) ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是三大基因編輯技術(shù)。基因編輯技術(shù)本質(zhì)上均是利用非同源末端鏈接途徑(NHEJ)修復(fù)和同源重組(HR)修復(fù)，聯(lián)合特異性DNA的靶向識別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變。

這三種編輯工具的共同點是：含有靶點DNA序列的識別區(qū)域及DNA剪切功能區(qū)域，其中ZFN技術(shù)具有鋅指結(jié)構(gòu)域能夠識別靶點DNA，而TALEN的DNA識別區(qū)域是重復(fù)可變雙殘基的重復(fù)，DNA剪切區(qū)域都是一種名為Fokl的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。CRISPR的DNA識別區(qū)域是crRNA或向?qū)NA，Cas9蛋白負(fù)責(zé)DNA的剪切。ZFN 的基因打靶效率能夠達到 30%左右，而TALE 分子的模塊組裝和篩選過程比較繁雜，需要大量的測序工作，對于普通實驗室的可操作性較低，而商業(yè)化公司構(gòu)建也需要花費上千美元，使用成本較高。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯是由crRNA 指導(dǎo)的，對靶序列的識別是 RNA 與 DNA 的堿基配對過程，相比蛋白質(zhì)對 DNA 序列的識別要精確更多，降低了脫靶切割的幾率，減低了細(xì)胞毒性。而且 CRISPR/Cas9 的構(gòu)建僅僅需要設(shè)計與靶序列互補的 RNA 即可，過程相對于 TALEN 更為簡單和廉價，普通的實驗室也可以自行完成構(gòu)建，這大大提高了基因操作的效率及簡便性。

(二) 功能基因組學(xué)中大規(guī)模篩選技術(shù)的必要性

自從人類基因組完成之后，科學(xué)家的最重要的任務(wù)是對標(biāo)記的基因進行研究，以了解它們在生理過程、疾病中所扮演的功能，但是高通量研究工具的缺乏再加上如此龐大的基因數(shù)，使得科學(xué)家的研究進展非常緩慢，CRISPR/Cas9 技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家們有了一種全基因組層面，高通量研究基因功能的工具。

(三) CRISPR/CAS9篩選技術(shù)舉例

以《Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system》（Science）為例。

①　文庫準(zhǔn)備：作者做了一個含有73,000個sgRNA的文庫，覆蓋了7000多個基因，每個基因平均有多個sgRNA與之對應(yīng)。

②　篩選原理：基于DNA錯配修復(fù)原理，MMR機制(mis-match repair，MMR)，如果細(xì)胞的DNA發(fā)生錯配損傷，此MMR系統(tǒng)發(fā)揮作用，進行修復(fù)，保證細(xì)胞的存活，MMR系統(tǒng)參與的蛋白有hMSH1-6和hMLH1-5等。如果把細(xì)胞放在6-硫鳥嘌呤環(huán)境中，6-硫鳥嘌呤將會強烈抑制MMR路徑，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。如果把這些蛋白敲減或失活，細(xì)胞在6-硫鳥嘌呤環(huán)境中存活，這類細(xì)胞也會得到富集。