上圖展示今年以來CRISPR文庫相關(guān)IF>20的文章列表的1/4。 這兩年，CRISPR/CAS9火到讓人習(xí)以為常。

利用其多方面的潛能，各種工具被開發(fā)出來，給科研工作者在生物體各個層面涂涂改改做研究提供了極大便利。簡單列舉如下表：

● DNA水平，可以實現(xiàn)精確基因編輯，大片段、單堿基都能hold??！

● RNA水平，轉(zhuǎn)錄調(diào)控RNA上下調(diào)，RNA干擾全都搞的定！

● 表觀遺傳水平，調(diào)控DNA堿基甲基化不是夢！

● 還有分子定位， 基因檢測(SHERLOCK) 等等等等

更關(guān)鍵的是，這些工具不僅可以對單分子進行操作，更強大到可以在組學(xué)水平進行全面篩選——那就是CRISPR相關(guān)文庫。

今天小編嘗試由淺入深，跟大家聊聊CRISPR文庫。

第一步：引發(fā)雙鏈DNA斷裂（DSB）

簡單來說，CRISPR/CAS9系統(tǒng)是蛋白-RNA復(fù)合體(RNP)，兩者結(jié)合，一起發(fā)揮功能：

● sgRNA，通過與DNA堿基互補配對將RNP定位于基因組

● Cas9，核酸內(nèi)切酶，切割DNA雙鏈誘發(fā)DSB（紅色箭頭）

至此，CRISPR/CAS9系統(tǒng)的使命——瞄準(zhǔn)了，切兩刀，結(jié)束。

第二步：利用細胞DSB修復(fù)機制——編輯基因組

CRISPR/CAS9造成一個DSB，而真正幫助我們實現(xiàn)目的的，其實是細胞本身的DNA修復(fù)機制： 

● 無模板，非同源介導(dǎo)的基因編輯（NHEJ)，不精確，引發(fā)移碼突變，實現(xiàn)基因敲除（KO，Loss of Function)

● 有模板，同源介導(dǎo)的基因修復(fù)（HDR），精確編輯

一點點補充：

● 有很多CRISPR系統(tǒng)只需要瞄準(zhǔn)了，即精確結(jié)合到DNA（或RNA）上；

● 不需要切兩刀，即通過點突變將CAS9的2個核酸內(nèi)切酶相關(guān)功能域失活；

● 通過與CAS9融合表達另外一個功能蛋白（心有多大，舞臺就有多大），實現(xiàn)其他功能，簡單列舉如下： 

附：SAM/Sun-tag/CRISPRa

下面我們以CRISPR/CAS9本體用于基因功能研究為例接著聊。

說起Loss of function，必提RNA干擾。那么，比一比？

● RNA干擾殘留目的基因仍舊可能維持其功能（圖左）

● CRISPR/CAS9可將基因完全消除進而揭示其功能（圖右）

先看流程

● 如果CAS9和sgRNA通過兩個載體導(dǎo)入細胞，那么需要就叫做“雙載體”系統(tǒng)，看左邊。

● 如果CAS9和sgRNA通過一個載體導(dǎo)入細胞，那么需要就叫做“單載體”系統(tǒng)，看右邊。

篩選原理？

主要原因是利用了慢病毒整合基因組的特性，以單載體文庫說明：

一定用慢病毒？

除了整合的特性，慢病毒還有如下特點，讓你不得不愛：

用RNAi文庫也可以進行Loss of Function篩選啊？

那我們對比一下RNAi和CRISPR/CAS9如下：

針對同一基因多靶點表型一致性這一關(guān)鍵數(shù)據(jù)，來源是Science：

所以，CRISPR/CAS9可能更有優(yōu)勢哦~

做好CRISPR/CAS9文庫篩選實驗的關(guān)鍵是什么呢？

結(jié)合流程，細胞感染、藥篩、收取細胞進行NGS都算是比較常規(guī)的操作，關(guān)鍵在：

CRISPR/CAS9文庫過關(guān)！具體來說：

a. 雖然張峰庫靶點有效率平均高達80%（見下圖），但還是需要多靶點設(shè)計保證針對每個基因都有有效靶點。

b. 若基因敲除后有功能，多靶點可以互相印證，避免脫靶帶來的假陽性

像張鋒的human GECKO文庫，大概有12萬+條sgRNA，經(jīng)過質(zhì)粒構(gòu)建、質(zhì)粒擴增，必須經(jīng)過NGS測序確保達到以下的高標(biāo)準(zhǔn)： 

a. 左圖，高覆蓋率。質(zhì)粒擴增后經(jīng)NGS，測到的sgRNA覆蓋率要爭取向“24K”的標(biāo)準(zhǔn)看齊——99.99%。

b. 右圖，高均一度。不同sgRNA靶點含量差距不能太大。

在文庫篩選過程中，我們期望除了藥物，其他刺激的影響越小越好。所以病毒必須高滴度、高純度、無污染：

更重要的是，慢病毒文庫也必須有向24K看齊的高覆蓋率和高均一度。 下面是慢病毒感染細胞后抽取基因組NGS的慢病毒文庫質(zhì)檢結(jié)果。

OK，經(jīng)過兩輪NGS測序，我才拿到了可以放心實驗的CRISPR慢病毒文庫。

前面雖然說簡單說說，現(xiàn)在也還越發(fā)覺得不簡單。反正我是覺得，如果讓我自己做個慢病毒文庫，簡直跟讀了半個博一樣。