CRISPR-Cas9系統(tǒng)源自細(xì)菌及古生菌的獲得性免疫系統(tǒng)，由于操作簡(jiǎn)單高效而成為一種強(qiáng)大的基因編輯工具。自2013年初發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA精確編輯開始，近年來呈現(xiàn)井噴式發(fā)展。相對(duì)于ZFN、TALEN等基因編輯技術(shù)來說，其更加簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、容易操作。令其成為迄今為止最為有效、低廉和容易的基因編輯方法。其在基因編輯(包括基因敲除、敲入、點(diǎn)突變)、基因治療(抗病毒感染（HPV¹、HIV²、HBV³、HSV），遺傳性疾病基因修正，如β地中海貧血、DMD等)、細(xì)胞免疫治療(CAR-T、CAR-NK、TCR-T中的CAR/TCR基因定點(diǎn)敲入及免疫檢查點(diǎn)基因敲除)、功能基因篩選(CRISPRi/a正負(fù)向篩選)等方面具有極重要的應(yīng)用意義。但是，在其廣泛應(yīng)用的背后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)有一個(gè)致命的缺點(diǎn)——容易脫靶，即在預(yù)期靶點(diǎn)以外的位點(diǎn)上產(chǎn)生額外的DNA剪切或編輯。脫靶可引起非預(yù)期的基因突變，甚至導(dǎo)致癌變發(fā)生，限制了CRISPR基因編輯的臨床應(yīng)用。因此，提高sgRNA的特異性，降低脫靶效率是未來CRISPR技術(shù)發(fā)展所需要攻克的難關(guān)。 

圖1:脫靶的原理（A）及錯(cuò)配的類型（B）

CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)揮作用依賴DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSB）的產(chǎn)生。細(xì)胞修復(fù)DSB時(shí)可能引入插入或缺失突變（indels），甚至更大范圍的染色體重排。因此，在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脫靶位點(diǎn)及其突變頻率是非常必要的，尤其是在CRISPR-Cas9系統(tǒng)被廣泛用于生物技術(shù)應(yīng)用的情況下。例如基因編輯應(yīng)用于人類疾病治療中，完整的脫靶位點(diǎn)分析可以幫助避免采用可能引起不良臨床結(jié)果的sgRNA。

現(xiàn)有多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)用于在全基因組范圍進(jìn)行脫靶位點(diǎn)檢測(cè)，可大致分為兩類：

（1）基于細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的體內(nèi)脫靶檢測(cè)，包括GUIDE-seq⁴、BLISS⁵、HTGTS⁶、DISCOVER-seq⁷等；（2）不依賴細(xì)胞的體外脫靶檢測(cè)，包括Digenome-seq⁸、SITE-seq⁹、CIRCLE-seq¹⁰和CHANGE-seq¹¹（CIRCLE-seq的改進(jìn)版），但每種技術(shù)均有其局限性。

體內(nèi)脫靶檢測(cè)：基于細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的體內(nèi)脫靶檢測(cè)方法對(duì)于不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系缺乏可操作性。GUIDE-seq⁴依賴標(biāo)簽序列dsODN整合入基因組，HTGTS⁶依賴染色體易位，二者均受細(xì)胞系DNA修復(fù)特異性和時(shí)效性、目標(biāo)位點(diǎn)特異性、細(xì)胞周期等因素的影響，同時(shí)因切割位點(diǎn)處dsODN未整合或未發(fā)生染色體易位而遺漏突變頻率低于0.1%的脫靶位點(diǎn)。DISCOVER-Seq⁷則是利用ChIP-seq的手段檢測(cè)Cas酶切割后產(chǎn)生的DSB修復(fù)因子MRE11在切割位點(diǎn)的富集，從而獲取切割位點(diǎn)信息。但是由于Cas酶并不是在同一時(shí)間內(nèi)切割不同位點(diǎn)，而是有時(shí)間先后順序，導(dǎo)致同一時(shí)間點(diǎn)MRE11因子富集的差異使檢測(cè)結(jié)果不能真實(shí)反映全部切割位點(diǎn)。另外，由于細(xì)胞內(nèi)本身也存在不少的非Cas酶切割產(chǎn)生的DSB，這部分DSB成為了其檢測(cè)的假陽性位點(diǎn)。

體外脫靶檢測(cè)：與體內(nèi)脫靶檢測(cè)方法相比，體外檢測(cè)脫靶的方法具有潛在的優(yōu)勢(shì)。使用純化的組分試劑進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，提高了檢測(cè)的可重復(fù)性，避免了細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞修復(fù)對(duì)檢測(cè)的影響。另外，體外實(shí)驗(yàn)中可大幅度提高sgRNA及Cas酶的濃度，有利于檢測(cè)出低頻突變位點(diǎn)。目前主要有3種體外全基因組范圍脫靶檢測(cè)的方法。

（1）Digenome-seq⁸：是最早的體外脫靶檢測(cè)方法，大概步驟為Cas酶體外切割目標(biāo)DNA，對(duì)所有游離斷端（無論是否由Cas酶切割產(chǎn)生的DSB）進(jìn)行加接頭處理，全基因組測(cè)序后分析出由Cas酶切割產(chǎn)生的在靶和脫靶位點(diǎn)。該方法需要很高的測(cè)序深度，有大量非Cas酶切割產(chǎn)生的隨機(jī)背景信號(hào)，缺乏全面檢測(cè)包含低頻位點(diǎn)在內(nèi)的全部脫靶位點(diǎn)的靈敏度，不適合用于大批量篩選sgRNA。

（2）SITE-seq⁹：隨后出現(xiàn)的SITE-seq檢測(cè)方案為盡量消除非Cas酶切割產(chǎn)生的DSB，采用高分子量基因組DNA作為Cas酶切割底物，對(duì)切割后的基因組DNA進(jìn)行生物素標(biāo)記、富集、測(cè)序并比對(duì)得到全面的切割位點(diǎn)信息。該方法所需的測(cè)序深度較Digenome-seq明顯下降，但缺點(diǎn)在于高分子量基因組DNA只能來源于新鮮組織和細(xì)胞，提取困難，DNA完整性難以保證，在提取DNA過程中可能會(huì)產(chǎn)生大量的DSB，最終導(dǎo)致分析結(jié)果的假陽性率高。

（3）CIRCLE-seq¹⁰：與SITE-seq同期出現(xiàn)的CIRCLE-seq檢測(cè)方案通過環(huán)化DNA作為Cas酶切割底物的方法去除背景DSB。該方法對(duì)打斷的基因組DNA連接一特殊的發(fā)夾樣接頭后，通過USER酶切開莖環(huán)結(jié)構(gòu)，再使用DNA連接酶將DNA首尾自身連接成環(huán)狀，之后采用Cas酶體外切割該環(huán)狀DNA，線性化的DNA加測(cè)序接頭后形成可測(cè)序文庫。這一脫靶檢測(cè)方案的缺點(diǎn)在于環(huán)化效率低，故而建庫需要的基因組DNA起始入量大（25ug），大大限制了該檢測(cè)方法在難以培養(yǎng)的原代細(xì)胞和珍貴臨床標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用，另一方面，未能成環(huán)的DNA無法徹底去除導(dǎo)致了分析結(jié)果中假陽性位點(diǎn)的存在。

（4）CHANGE-seq¹¹：為CIRCLE-seq的改進(jìn)優(yōu)化版本，采用Tn5建庫加接頭聯(lián)合USER酶產(chǎn)生粘性末端的方法，提高了成環(huán)的效率，降低了DNA用量。但是也存在不可忽視的假陽性問題，它主要是由游離的DSB斷端導(dǎo)致的，因此我們開始尋求降低背景DSB斷端以期降低假陽性的方法。

  圖2:常用的基因編輯脫靶檢測(cè)方法示意圖¹²

經(jīng)過多年不懈努力，珠海舒桐團(tuán)隊(duì)最終成功開發(fā)出高敏感特異的體外脫靶檢測(cè)方法AID-seq，于2023年6月5日發(fā)表于Cell旗艦子刊Med雜志¹³（Massively parallel CRISPR off-target detection enables rapid off-target prediction model building。

原文鏈接：https://www./med/pdf/S2666-6340(23)00163-0.pdf）

 AID-seq的詳細(xì)工作流程如圖3所示。簡(jiǎn)而言之，基因組DNA被隨機(jī)打斷并與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的i7接頭連接，形成“啞鈴狀”結(jié)構(gòu)。然后，使用三種不同的核酸外切酶混合物將游離的DNA消化，該步驟可重復(fù)2-4次，以最大程度去除背景DSB產(chǎn)生的假陽性。剩余的雙端成功連接上接頭的“啞鈴狀”DNA與Cas9或Cas12a核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物進(jìn)一步孵育，暴露新切割的DNA末端，然后與生物素修飾的i5接頭連接。這些生物素接頭連接的DNA將通過鏈霉親和素磁珠富集。最后，通過巢式PCR構(gòu)建上機(jī)文庫。

  圖3:AID-seq方法示意圖

1、AID-seq的靈敏度和特異性均優(yōu)于現(xiàn)有的脫靶檢測(cè)方法

本研究使用了7個(gè)之前GUIDE-seq、SITE-seq、CIRCLE-seq和CHANGE-seq文獻(xiàn)已充分檢測(cè)脫靶的sgRNA位點(diǎn)，包括VEGFA site 1、VEGFA site 2、VEGFA site 3、EMX1、FANCF、HEK293 site 4和PAPSS2。我們將上述兩種或多種脫靶檢測(cè)方法檢測(cè)到的脫靶歸類為真陽性脫靶。

對(duì)于上述7個(gè)sgRNA，我們都進(jìn)行了AID-seq，并且生物學(xué)復(fù)孔之間差異極小。與SITE-seq、CIRCLE-seq和CHANGE-seq相比，AID-seq可以檢測(cè)到更多的GUIDE-seq脫靶（表1）。注：GUIDE-seq體內(nèi)脫靶檢測(cè)方法能反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)真實(shí)切割情況，因此用GUIDE-seq檢測(cè)到的脫靶位點(diǎn)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

  表1:不同體外脫靶檢測(cè)方法檢測(cè)的GUIDE-seq脫靶情況

我們進(jìn)一步使用PR曲線和ROC曲線來可視化不同脫靶檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。如圖4所示，與SITE-seq、CIRCLE-seq和CHANGE-seq相比，AID-seq在三個(gè)測(cè)試中的AUPRC和AUROC得分最高。說明AID-seq無論是在敏感性還是在特異性上，都略勝一籌。

圖4:AID-seq的敏感性和特異性均高于現(xiàn)有體外脫靶檢測(cè)方法

2、除檢測(cè)Cas9的脫靶外，AID-seq還可檢測(cè)Cas12a的脫靶

Cas12a產(chǎn)生粘性末端并具有非特異性切割活動(dòng)的特性。為確定AID-seq是否可用于檢測(cè)Cas12a的脫靶，我們選擇了GUIDE-seq文獻(xiàn)中的7個(gè)位點(diǎn)。如圖5所示。AID-seq可以檢測(cè)多個(gè)GUIDE-seq遺漏的位點(diǎn)，并且AID-seq檢測(cè)到的這些位點(diǎn)進(jìn)一步在細(xì)胞水平通過擴(kuò)增子的方法驗(yàn)證為真陽性脫靶位點(diǎn)。因此，AID-seq可作為全面、準(zhǔn)確檢測(cè)Cas12a脫靶位點(diǎn)的可靠工具。

圖5:AID-seq檢測(cè)Cas12a（cpf1）的脫靶

3、AID-seq可同時(shí)檢測(cè)多條sgRNA的在靶和脫靶，用于sgRNA篩選

目前的on-/off-target檢測(cè)策略采用單個(gè)gRNA的形式，成本高且通量低。為了確定AID-seq是否可用于一次檢測(cè)多個(gè)gRNA的脫靶情況，我們分別對(duì)16個(gè)sgRNA和66個(gè)sgRNA的兩個(gè)不同大小的sgRNA文庫進(jìn)行了AID-seq。兩個(gè)sgRNA文庫都包含表1中7個(gè)文獻(xiàn)sgRNA作為陽性對(duì)照。結(jié)果表明，pooled AID-seq的生物學(xué)復(fù)孔可重復(fù)性高（圖6A）。并且，大部分的GUIDE-seq脫靶位點(diǎn)都可以被pooled AID-seq檢測(cè)到，與單個(gè)AID-seq一樣敏感（圖6B和6C）。

圖6:Pooled AID-seq同時(shí)檢測(cè)多條sgRNA的切割效率和脫靶效應(yīng)

4、利用AID-seq快速獲取新型CRISPR的脫靶數(shù)據(jù)，并建立脫靶預(yù)測(cè)模型

我們?nèi)ツ?月發(fā)現(xiàn)了一種新的高保真CRISPR—FrCas9¹⁴，相關(guān)文章發(fā)表于Nature Communications。但是，亟需建立一個(gè)脫靶預(yù)測(cè)模型以促進(jìn)FrCas9的應(yīng)用。然而，這是一項(xiàng)耗時(shí)耗力的工作，因?yàn)樾枰罅繙?zhǔn)確的脫靶數(shù)據(jù)。為了解決這個(gè)問題，我們使用pooled AID-seq策略來表征FrCas9在2,069個(gè)sgRNA中的切割效率和脫靶效應(yīng)，每個(gè)sgRNA文庫中約有500個(gè)sgRNA。結(jié)果表明，每個(gè)文庫的在靶率≥95%，并且一半以上的sgRNA沒有檢測(cè)到脫靶，這與我們之前的研究一致，再次驗(yàn)證了FrCas9的高靶點(diǎn)切割活性及低脫靶效應(yīng)（Cas-Designer網(wǎng)站已上線FrCas9 sgRNA在線設(shè)計(jì)http://www./cas-designer/）。通過分析AID-seq產(chǎn)生的大量的脫靶數(shù)據(jù)，我們建立了準(zhǔn)確FrCas9脫靶預(yù)測(cè)模型（AUROC=0.97，AUPRC=0.29）。目前該脫靶預(yù)測(cè)模型已在舒桐官網(wǎng)上線（官網(wǎng)鏈接：http://www./crispr）。

  圖7:Pooled AID-seq用于新型CRISPR的快速建模

AID-seq是一種新型準(zhǔn)確且高通量的方法，用于檢測(cè)不同類型CRISPR（包括Cas9和Cas12a）的靶向活性和脫靶效應(yīng)。相對(duì)于以往的體內(nèi)外脫靶檢測(cè)方法，AID-seq具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，作為一種體外脫靶檢測(cè)方法，其應(yīng)用范圍更廣，不受不同物種（人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等）^4,7、不同細(xì)胞類型（細(xì)胞系、原代細(xì)胞、非分裂細(xì)胞等）和轉(zhuǎn)染效率的影響。其次，AID-seq不需要提取完整的高分子量DNA，DNA起始入量也很?。?ug），因此對(duì)DNA制備難度大的實(shí)驗(yàn)更加友好。第三，AID-seq可以檢測(cè)更多的低頻和真正的脫靶，這對(duì)基因治療至關(guān)重要。因?yàn)榧词故巧贁?shù)具有脫靶編輯的細(xì)胞也可能因克隆擴(kuò)增而導(dǎo)致癌癥。

更重要的是，我們提出了pooled AID-seq策略來同時(shí)檢測(cè)數(shù)百個(gè)gRNA的on-/off-target，這可能會(huì)大大提高CRISPR on-/off-target檢測(cè)的通量和效率。在我們的研究中，sgRNA文庫大小從幾條sgRNA到數(shù)百條不等，可以適應(yīng)以下不同的應(yīng)用場(chǎng)景。首先，通過pooled AID-seq策略可以篩選出切割效率最高、脫靶效應(yīng)最低的sgRNA進(jìn)行基因編輯和治療。其次是用于CRISPR文庫優(yōu)化：CRISPR文庫常用于識(shí)別藥物敏感性和耐藥性的基因^15,16，然而，文庫可能包含性能不佳的sgRNA，增加了不必要的文庫大小并導(dǎo)致強(qiáng)烈的混雜效應(yīng)¹⁷。因此，有必要使用pooled AID-seq策略針對(duì)全基因組或一類特殊目標(biāo)篩選最佳sgRNA減少文庫大小和提高文庫性能。最后，AID-seq可用作通用工具，以大規(guī)模并行方式表征新發(fā)現(xiàn)的CRISPR的特性^18,19，如切割效率、脫靶效應(yīng)和PAM偏好，并基于這些大量的數(shù)據(jù)構(gòu)建脫靶預(yù)測(cè)模型。

珠海舒桐長(zhǎng)期致力于基因編輯脫靶檢測(cè)，是國內(nèi)首家提供基因編輯脫靶檢測(cè)服務(wù)的公司，已協(xié)助多家生物醫(yī)藥企業(yè)成功申報(bào)IND。目前提供的脫靶檢測(cè)包括：GUIDE-seq體內(nèi)脫靶檢測(cè)、AID-seq體外脫靶檢測(cè)、擴(kuò)增子脫靶位點(diǎn)驗(yàn)證、PEM-seq染色體重排檢測(cè)、慢病毒整合位點(diǎn)檢測(cè)、全基因組測(cè)序脫靶位點(diǎn)檢測(cè)、RNA脫靶檢測(cè)等多種方法。如需提供上述服務(wù)，歡迎垂詢！

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