自誕生之初，CRISPR基因編輯技術(shù)一直無法克服的難題就脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)有可能導(dǎo)致基因突變，其不確定性和未知的安全風(fēng)險限制了基因編輯技術(shù)的推廣應(yīng)用。目前的基因編輯技術(shù)尚無法精準(zhǔn)靶向目標(biāo)序列，并不產(chǎn)生脫靶效應(yīng)?？茖W(xué)家認(rèn)為，既然無法完全避免，為安全起見，更好地了解、控制可能產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)是一個不錯的選擇。因此，脫靶檢測方法的開發(fā)成為了基因編輯領(lǐng)域的一個研究熱點。

近日，國際頂級學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》報道了一種新型基因編輯脫靶檢測方法，名為DISCOVER-Seq （Discovery of in situ Cas off-targets and verification by sequencing）。該方法可利用細(xì)胞和生物中DNA修復(fù)因子的募集特征，準(zhǔn)確鑒定體內(nèi)基因編輯細(xì)胞的脫靶位點和Cas活性的分子表征。該研究由加利福尼亞大學(xué)伯克利分校創(chuàng)新基因組研究所(IGI)、格拉德斯通研究所(Gladstone Institute)和阿斯利康(AstraZeneca)的研究團(tuán)隊共同完成，文章題為“Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq”。

雖然已經(jīng)有不同的方法檢測CRISPR脫靶效應(yīng)，但這些方法在實際應(yīng)用中存在各種限制。例如，目前的脫靶檢測方法多使用純化的DNA或特定的細(xì)胞模型，無法實現(xiàn)體內(nèi)直接檢測，并且存在產(chǎn)生假陽性結(jié)果以及殺死被檢測的細(xì)胞等問題。此外，最常用的檢測方法仍僅限于實驗室培養(yǎng)的細(xì)胞，不適用于患者來源的干細(xì)胞或者動物組織。

新開發(fā)的DISCOVER-Seq方法，可通過精確追蹤體內(nèi)DNA修復(fù)因子的募集，以單堿基分辨率揭示細(xì)胞中CaS活性的分子特性。經(jīng)研究驗證，DISCOVER-Seq適用于多種gRNA格式和Cas酶類型，并可用于表征新的編輯工具。此外，經(jīng)研究驗證，該方法可在患者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和小鼠細(xì)胞等任何生物系統(tǒng)的基因編輯過程中實時檢測脫靶效應(yīng)，而不僅限于實驗室培養(yǎng)的細(xì)胞，為基因編輯治療期間患者體內(nèi)脫靶檢測鋪平了道路。

圖1. DISCOVER-Seq工作流程

文章第一作者、IGI博士后研究員Beeke Wienert表示：“在CRISPR切割時會破壞DNA。為了生存，細(xì)胞會將許多不同的DNA修復(fù)因子募集到基因組中的特定位點，修復(fù)斷裂并將切割末端連接在一起。如果我們能夠找到這些DNA修復(fù)因子的位置，也就可以識別被CRISPR切割的位點?！?/span>

由于DNA修復(fù)蛋白可以利用ChIP-Seq鑒定化膿性鏈球菌Cas9靶點，所以該研究對不同的DNA修復(fù)蛋白進(jìn)行了分析，并重點研究了MRN復(fù)合物的MRE11亞基。MRE11是第一個被募集到切割位點的修復(fù)蛋白，會緊密分布在Cas9切割位點周圍。研究發(fā)現(xiàn)，在基因插入和缺失出現(xiàn)之前，MRE11與損傷DNA的結(jié)合就會達(dá)到高峰，并且在已知gRNA脫靶時很容易被檢測到。

研究人員表示：“人類基因組非常龐大，如果打印完整的DNA序列，會得到一本16層樓高的小說。當(dāng)我們用CRISPR切割DNA時，就像刪除該小說中特定頁面上的某個特定單詞一樣。DNA修復(fù)因子就像在書中添加不同類型的書簽，有的標(biāo)簽是針對整個章節(jié)，但MRE11可以確切到某一個字母?！?/span>

圖2. DISCOVER-Seq可在患者衍生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和小鼠體內(nèi)進(jìn)行實時的脫靶檢測。

在基因組檢測中，DISCOVER-Seq可以利用MRE11鑒定CRISPR切割的確切位點，檢測結(jié)果更可靠。大多數(shù)MRE11 ChIP-Seq的檢測結(jié)果與預(yù)測的Cas9切割位點一致，進(jìn)而能夠以單堿基分辨率鑒定核酸酶位點，揭示Cas活性的分子特征。需要注意的是，DISCOVER-Seq檢測方法依賴于細(xì)胞的自然修復(fù)過程，侵入性更小，且適用于多種gRNA形式和Cas酶類型。

通過應(yīng)用于新的細(xì)胞類型和系統(tǒng)，DISCOVER-Seq還能揭示CRISPR基因組編輯機(jī)制的新見解，有助于人們更好地理解CRISPR的工作原理。DISCOVER-Seq大大簡化了脫靶的檢測過程，同時提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，該方法有助于我們更好地預(yù)測基因組編輯在臨床環(huán)境中的運(yùn)作方式，改善臨床前研究，使基于CRISPR的療法更能滿足有需求的患者。

在基因編輯脫靶檢測方面，我國科學(xué)家也在不斷努力。今年3月，中國科學(xué)院等單位的研究人員成功開發(fā)了一種新型脫靶檢測技術(shù)GOTI，該技術(shù)可在不借助于任何脫靶位點預(yù)測技術(shù)的情況下發(fā)現(xiàn)隨機(jī)脫靶位點，顯著提高了基因編輯脫靶檢測的敏感性。點擊鏈接，查看此前報道

在治愈人類罕見病、遺傳病方面，基因編輯技術(shù)被寄予厚望，但在過去的幾十年中，科學(xué)家始終難以克服脫靶效應(yīng)這個難題，這也成為制約該技術(shù)成功應(yīng)用于臨床的一大瓶頸。在更安全有效的基因編輯工具出現(xiàn)之前，精準(zhǔn)的脫靶檢測技術(shù)或?qū)⒊蔀榛蚓庉嫾夹g(shù)臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。

參考資料：

1. Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq

https://science./content/364/6437/286.full?_ga=2.217470229.2076339049.1556000128-1911026261.1556000128

2. DISCOVER-Seq Detects Off-Target CRISPR Effects

https://www./news/discover-seq-detects-off-target-crispr-effects/

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