CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌和古菌特有的一種天然防御系統(tǒng)，用于抵抗病毒或外源性質(zhì)粒的侵害。當外源基因入侵時，該防御系統(tǒng)的 CRISPR 序列會表達與入侵基因組序列相識別的 RNA，然后 CRISPR 相關(guān)酶(Cas)在序列識別處切割外源基因組DNA，從而達到防御目的。

根據(jù)Cas蛋白的特點，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)需要借助復雜的蛋白復合體發(fā)揮作用，Ⅱ型系統(tǒng)僅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可對靶目標進行編輯，結(jié)構(gòu)簡單，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。

CRISPR/Cas自誕生以來，迅速發(fā)展，已經(jīng)成為生命科學領域最耀眼、最有前景的技術(shù)。尤其是近兩年，在全世界科學家的共同努力下，CRISPR/Cas相關(guān)新進展新突破不斷涌現(xiàn)。

一、基因編輯技術(shù)的發(fā)展史

基因編輯可以分為三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。這三個基因編輯技術(shù)都利用了DNA修復機制，所以我們先來了解一下DNA修復機制（圖1）。

圖1-NHEJ修復（左），HDR修復（右）

NHEJ（Non-homologous end joining）

非同源性末端接合

NHEJ修復機制不需要任何模版，修復蛋白直接將雙股裂斷的DNA末端彼此拉近，在DNA連接酶的幫助下重新接合（圖1）。

HDR（Homology directed repair）

同源重組修復

當細胞核內(nèi)存在與損傷DNA同源的DNA片段時，HDR才能發(fā)生。

NHEJ的機制簡單又不依靠模版，因而NHEJ的活性相對于HDR高出許多。但NHEJ修復出錯的概率較高，容易造成移碼突變等，基因編輯正是利用了這一點（圖1）。

1.ZFN的識別切割機制

融合鋅指模塊和FokI切割結(jié)構(gòu)域形成ZFN ；以二聚體的形式靶向切割每個鋅指結(jié)構(gòu)；特異識別3個堿基  ；組裝多個鋅指結(jié)構(gòu)(識別12-18bp)形成的ZFN對可特異切割基因組靶點 （圖2）。

圖2-ZFN基因編輯原理圖

2.TALEN的識別切割機制

兩個TALE靶向識別靶點兩側(cè)的序列；每個TALE融合一個FokI內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域；FokI通過TALE靶向形成二聚體切割靶點；設計靈活識別特異性強（圖3）。

圖3-TELEN基因編輯原理圖

3.CRISPR/Cas9的識別切割機制

crRNA通過堿基配對與 tracrRNA結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA（圖4）。

圖4-CRISPR/Cas9基因編輯原理圖

ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比較

圖5-三種基因編輯的比較

二、CRISPR/Cas技術(shù)的介紹

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

1987年，在大腸桿菌的基因組中首次發(fā)現(xiàn)了一個特殊的重復間隔序列——CRISPR序列，隨后，在其他細菌和古菌中也發(fā)現(xiàn)了這一特殊序列。

2005年，發(fā)現(xiàn)這些CRISPR序列和噬菌體的基因序列匹配度很高，說明CRISPR 可能參與了微生物的免疫防御。

2011年，CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子機制被揭示：當病毒首次入侵時，細菌會將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區(qū)；病毒二次入侵時，CRISPR 轉(zhuǎn)錄生成 前體crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 經(jīng)過加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別后，介導 Cas 蛋白結(jié)合并切割，從而保護自身免受入侵。

2013年，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效地編輯基因組。隨后張鋒等使用CRISPR系統(tǒng)成功的在人類細胞和小鼠細胞中實現(xiàn)了基因編輯。

從此開始，CRISPR/Cas9技術(shù)給生命科學領域帶來了巨大沖擊，CRISPR/Cas9相關(guān)研究成果頻頻登上CNS等頂級期刊，近兩年更是成為諾貝爾獎熱門候選。

CRISPR/Cas技術(shù)的原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過堿基配對與 tracrRNA（trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而通過人工設計   crRNA 和 tracrRNA 這兩種 RNA，改造成具有引導作用的sgRNA （single guide RNA ），從而引導 Cas9 對 DNA 的定點切割（圖4）。

CRISPR/Cas技術(shù)的優(yōu)勢

設計簡單，簡明的堿基互補設計原則，識別不受基因組甲基化影響，能靶向幾乎任意細胞任意序列，方便同時靶向多個靶點，切割效率高。

三、CRISPR/Cas的脫靶效應

PAM (Protospacer adjacent motif )

前間區(qū)序列鄰近基序

PAM序列區(qū)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)行使切割功能的基本條件。如果靶序列 3′端沒有PAM序列，即使靶序列與sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不會切割該序列位點。 PAM序列主要影響CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在細胞水平上，NGG介導的切割效率是最高的。

sgRNA (Single guide RNA )

向?qū)?RNA

sgRNA與目標基因組相結(jié)合的 20nt 序列區(qū)決定著 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的靶向特異性。CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性其實主要依賴于sgRNA與靠近PAM區(qū)的10~12 bp的堿基配對，而其余遠離PAM序列 8~10 bp 堿基的錯配對靶位點識別的影響并不明顯。目前研究結(jié)果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是決定特異性的關(guān)鍵，其他序列也均在不同程度上影響脫靶效應。

CRISPR/Cas9的脫靶效應給研究帶來了一定程度上的不確定性，也是限制其發(fā)揮更大潛力的主要原因之一。

2017年5月30日，Nature雜志子刊Nature Methods刊登了美國哥倫比亞大學研究人員的一篇文章，研究人員通過CRISPR/Cas9成功修復了導致小鼠失明的基因后，對小鼠進行全基因測序，發(fā)現(xiàn)修復后的小鼠基因組有超過1500個單核苷酸突變，以及超過100個位點發(fā)生大片段插入或缺失（圖6）。文章的結(jié)論無疑引發(fā)了巨大震動，也給正在進行中的CRISPR/Cas9帶來了不確定性。

圖6--動物體內(nèi)實驗中CRISPR/Cas9編輯后發(fā)生意想不到的突變

仔細分析后，發(fā)現(xiàn)該文章并不十分嚴謹，文章僅有兩只小鼠作為實驗組，一只作為對照組，數(shù)量不足以證明結(jié)論是否只是個例。而且單堿基突變是生物體內(nèi)自然現(xiàn)象，不能全歸于CRISPR/Cas9。整個實驗只基于一個sgRNA數(shù)據(jù)，且該sgRNA特異性評分很低，造成脫靶效應也應該在預料之中（圖7）。

圖7--針對Nature Methods文章的回應

經(jīng)過一系列的研究和改進，目前CRISPR系統(tǒng)的脫靶性已經(jīng)很低，當然，要想達到理想的狀態(tài)，還有很長的路要走。

四、CRISPR/Cas技術(shù)的進展

2016年6月，張鋒在Science發(fā)表文章，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas13a能有切割細菌的特定RNA序列。

2016年9月，Jennifer Doudna在Nature發(fā)表文章，證實CRISPR/Cas13a可以用于RNA檢測。

2017年2月22日，美國紀念斯隆.凱特林癌癥中心（MSK）研究人員在Nature雜志發(fā)文，使用腺相關(guān)病毒（AAV）介導，將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應用于CAR-T療法。該研究既解決了傳統(tǒng)CAR-T療法的隨機整合可能存在的潛在危害，又大大降低了CAR-T細胞發(fā)生分化或癌化的風險，賦予了CAR-T技術(shù)全新的高效性、穩(wěn)定性、安全性。

2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在Nature發(fā)表長文，使用CRISPR/Cas9技術(shù)修正了植入子宮前的人類胚胎中一種和遺傳性心臟病有關(guān)的變異。該研究證實了通過編輯人類胚胎進行治療遺傳病是安全可行的。值得一提的是，該成果受到了基因編輯領域大牛George Church等人的質(zhì)疑。

2017年8月11日，楊璐菡等在Science發(fā)表文章，通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除豬基因組中的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小豬。向最終實現(xiàn)使用豬器官進行人體器官移植的終極目標邁進了一大步。

2017年9月，雜交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除與鎘吸收和積累相關(guān)基因的水稻育種成功。該研究從根本上解決了水稻鎘污染的問題，將扭轉(zhuǎn)我國部分農(nóng)作物重金屬超標的問題，進而改善部分人群重金屬慢性中毒的問題。

2017年10月4日，張鋒在Nature發(fā)表論文證實CRISPR/Cas13a能夠在哺乳動物細胞中編輯特定的RNA。CRISPR/Cas13a能夠達到RNAi相似的降低基因表達的效率，而且有更強的特異性，且對細胞內(nèi)天然的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡的影響更小。

2017年10月19日，Jennifer Doudna在Nature發(fā)表文章，設計了高精確性的Cas9變體—HypaCas9。該研究極大地降低了Cas9的脫靶效應，且不降低靶向切割效率。

2017年10月25日，張鋒在Science發(fā)表文章介紹CRISPR新系統(tǒng)--REPAIR，可以高效的進行RNA的單堿基修復。因為不改變DNA序列，所以為通過基因編輯治療遺傳病而又不永久影響基因組提供了新可能。

2017年10月25日，哈佛大學Broad研究所的David Liu實驗室在Nature發(fā)表長文，報道了新型腺嘌呤基因編輯器——ecTadA-dCas9，可以將A·T堿基對轉(zhuǎn)換成G·C堿基對，該技術(shù)首次實現(xiàn)了不依賴DNA斷裂即可進行基因編輯的技術(shù)，即單堿基基因編輯技術(shù)。該技術(shù)高于其它基因組編輯方法的效率，且?guī)缀鯖]有隨機插入、刪除或其它突變等不良副作用，因此為今后大范圍治療點突變遺傳疾病提供了極大的便利。

五、展望

近幾年CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，推廣應用到了生物、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等多個領域，造就了一批批科研奇跡，尤其是在遺傳病的治療、疾病相關(guān)基因的篩查與檢測、腫瘤治療以及動植物的改造、病原微生物防治等領域有著巨大的潛力，也將深遠地影響整個世界。

特別感謝：BioArt主編給予的幫助和意見以及吉滿生物吳晨提供圖1-圖5的圖片。