CRISPR/Cas9簡(jiǎn)介

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)。在這一系統(tǒng)中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA(trans-activating RNA)結(jié)合形成雙鏈RNA。此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體引導(dǎo)Cas9蛋白與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)處剪切雙鏈DNA，產(chǎn)生一個(gè)平末端的雙鏈DNA缺口（Double Strand Breaks，DSB）。通過(guò)基因工程手段將crRNA/tracrRNA進(jìn)行融合改造成一條sgRNA（Single Guide RNA），也能有效引導(dǎo)Cas9蛋白在靶點(diǎn)處進(jìn)行切割。

圖1 CRISPR/Cas9切割DNA示意圖

使用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因敲除的技術(shù)原理

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，大部分DSB會(huì)通過(guò)非同源的末端連（NonHomologous End-Joining，NHEJ）途徑或者同源重組修復(fù)（Homology-Directed Repair，HDR）途徑進(jìn)行修復(fù)。通常情況下的NHEJ 修復(fù)途徑占優(yōu)勢(shì)，且容易導(dǎo)致缺口處產(chǎn)生插入或缺失突變（Indels）。

當(dāng)使用一條sgRNA在蛋白編碼基因的外顯子內(nèi)產(chǎn)生DSB時(shí)，若NHEJ修復(fù)導(dǎo)致了缺口處產(chǎn)生了非3倍數(shù)的indels，則會(huì)造成蛋白翻譯時(shí)的讀碼框移碼（Framshift），不再產(chǎn)生完整的蛋白，即“移碼敲除”。

當(dāng)使用兩條sgRNA同時(shí)作用造成兩個(gè)DSB時(shí)，NHEJ修復(fù)不但可造成染色體DNA片段的缺失，同時(shí)也可能造成讀碼框移碼。這種基因組的雙重修飾更強(qiáng)有力地破壞了編碼蛋白的表達(dá)，即“片段敲除”。

圖2 使用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因敲除示意圖

使用CRISPR/Cas9進(jìn)行點(diǎn)突變/基因敲入的技術(shù)原理

在外源供體DNA存在的情況下，供體DNA有幾率通過(guò)同源重組的方式與切口處附近的基因組DNA進(jìn)行堿基片段交換，因此HDR修復(fù)途徑能進(jìn)行精確的基因修飾。供體DNA作為修復(fù)模板，包含一段目的序列，其兩側(cè)序列與切口附近的基因組序列一致作為同源臂。這種供體DNA可以是單鏈的DNA（ssDNA），也可以是雙鏈的DNA（dsDNA）。對(duì)于小的序列修改（如點(diǎn)突變），可以選擇合成ssDNA Oligo作為修復(fù)模板。當(dāng)需要進(jìn)行大片段的序列修改時(shí)（如敲入熒光蛋白標(biāo)簽），則需要將目的序列與數(shù)百堿基長(zhǎng)度的同源臂克隆至供體質(zhì)粒，使用供體質(zhì)粒作為修復(fù)模板。

HDR通常只活躍在分裂細(xì)胞中，受細(xì)胞狀態(tài)和基因位點(diǎn)影響，其效率較NHEJ更低。