人類基因組包含約30億個(gè)DNA堿基對(duì)，所有的遺傳秘密都蘊(yùn)藏其中，一旦基因出現(xiàn)錯(cuò)誤，就會(huì)引起嚴(yán)重的后果，這也是所謂的遺傳疾病的來源。從20世紀(jì)中期開始的分子生物學(xué)革命，使人類在破譯基因的遺傳密碼方面不斷取得突破，科學(xué)家們于是想進(jìn)一步通過修改基因來從根本上治愈疾病，隨著理論的不斷積累，基因編輯技術(shù)的應(yīng)用日益顯現(xiàn)。

基因編輯（Gene editing）是指特異性改變基因序列，利用酶（特別是核酸酶）來對(duì)DNA鏈進(jìn)行剪切，移除已有的DNA，或者插入代替的DNA。它的基本原理其實(shí)有點(diǎn)類似于word程序中的查找、替換或者刪減過程，即人為地修飾宿主細(xì)胞DNA序列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定目的基因片段的“編輯”（即敲除/敲入），從而達(dá)到改變宿主細(xì)胞的基因型的目的。

基因編輯技術(shù)仿佛是一把有魔力的“剪刀”，它既可以“剪切”基因，也可以應(yīng)用于“修補(bǔ)”基因。通過對(duì)DNA序列的改變和修正，破壞有毒或抑制性基因的功能（或恢復(fù)必要基因的功能），來實(shí)現(xiàn)遺傳治療。

隨著科學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步，基因編輯技術(shù)日趨成熟，對(duì)基因組的編輯也變得越來越簡(jiǎn)單，特別是第三代技術(shù)CRISPR/Cas9的出現(xiàn)「CRISPR/Cas9目前被認(rèn)為是最簡(jiǎn)單高效的基因編輯手段」。本文將帶著大家回顧一下基因編輯的發(fā)展歷史。

基因編輯發(fā)展歷程

資料來源: Synthego官網(wǎng)

同源重組技術(shù)(homologous recombination, HR)是最早的基因編輯技術(shù)，也是真核生物基因編輯的一個(gè)重大突破。其原理是將外源性目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，通過同源序列交換，使外源性DNA片段取代原位點(diǎn)上的基因，從而達(dá)到使特定基因失活或修復(fù)缺陷基因的目的。但是對(duì)高等真核生物來說，外源DNA與目的DNA自然重組率非常低，只有1/10E7—1/10E6；若要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，至少需要兩代遺傳，因此HR的大規(guī)模應(yīng)用受到了一定的限制。

為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，一系列基于核酸酶的基因編輯技術(shù)相繼出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了在真核生物尤其是哺乳動(dòng)物中精準(zhǔn)有效的基因編輯。與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比，基于核酸酶的基因編輯技術(shù)減少了外源基因隨機(jī)插入，提高了對(duì)基因組特定片段進(jìn)行精確修飾的幾率?；贒NA核酸酶的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，從第一代DNA核酸酶編輯系統(tǒng)ZFN、第二代TALEN到第三代CRISPR/Cas9系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高、成本逐漸降低，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。

1. 鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）

出現(xiàn)時(shí)間：1996年

組成單元：DNA結(jié)合的鋅指蛋白區(qū)域（負(fù)責(zé)識(shí)別DNA位點(diǎn)）和限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ的核酸酶切活性區(qū)域（負(fù)責(zé)切割DNA）

該技術(shù)使人工定點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂成為現(xiàn)實(shí)，實(shí)現(xiàn)了基因編輯技術(shù)里程碑式的突破；2001年開始陸續(xù)用于不同物種的基因編輯，構(gòu)建基因編輯模式生物的同時(shí)也用于遺傳育種和基因治療。

ZFN的結(jié)構(gòu)及作用原理圖

2. 轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)

出現(xiàn)時(shí)間：2009年

組成單元：識(shí)別特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)蛋白(transcription-activator-like effector，TALE)和核酸內(nèi)切酶FokⅠ（組成與ZFN類似）

該技術(shù)大大提高編程性能，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，自2011年建立后迅速用于構(gòu)建基因修飾動(dòng)物模型、遺傳育種和基因治療等領(lǐng)域，并入選為2012年的《科學(xué)》（Science）年度十大科技突破之一。

TALEN的結(jié)構(gòu)及作用原理圖

3. CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)

出現(xiàn)時(shí)間：2012年

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌中進(jìn)化出來用于抵御噬菌體及外源DNA入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，通過CRISPR RNA (crRNA)和trans-activating crRNA (tracrRNA)以及Cas9蛋白組成的復(fù)合體抵御外源性DNA的入侵。

當(dāng)外源基因入侵時(shí)，該防御系統(tǒng)的 CRISPR 序列會(huì)表達(dá)與入侵基因組序列相識(shí)別的 RNA，然后 CRISPR 相關(guān)酶(Cas)在序列識(shí)別處切割外源基因組DNA，從而達(dá)到防御目的。

組成單元：由Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)組成，sgRNA是根據(jù)crRNA和tracrRNA形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的。人工設(shè)計(jì)的gRNA（ guide RNA）來識(shí)別目的基因組序列，并引導(dǎo)Cas9蛋白酶進(jìn)行有效切割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂，損傷后修復(fù)會(huì)造成基因敲除或敲入等。

基因編輯技術(shù)的基本原理，圖片來自origene.com

根據(jù)Cas蛋白的特點(diǎn)，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)需要借助復(fù)雜的蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用，Ⅱ型系統(tǒng)僅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可對(duì)靶目標(biāo)進(jìn)行編輯，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。

由于該技術(shù)較前兩代技術(shù)設(shè)計(jì)和制備更加簡(jiǎn)單，成本更低，編輯效率更高，CRISPR/Cas自誕生以來，迅速發(fā)展，已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域最耀眼、最有前景的技術(shù)。連續(xù)多年被《Nature》評(píng)為最有前景的技術(shù)之一，2015年被《Science》評(píng)為技術(shù)突破第一名，2014、2016年被《麻省理工科技評(píng)論》評(píng)為10項(xiàng)突破技術(shù)之一，2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

近幾年CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，推廣應(yīng)用到了生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域，造就了一批批科研奇跡，尤其是在遺傳病的治療、疾病相關(guān)基因的篩查與檢測(cè)、腫瘤治療以及動(dòng)植物的改造、病原微生物防治等領(lǐng)域有著巨大的潛力，也將深遠(yuǎn)地影響整個(gè)世界。

三代基因編輯技術(shù)對(duì)比資料