在許多細(xì)菌和古細(xì)菌中， CRISPR 形成了獨(dú)特的遺傳基因座，這些基因座特異性靶向病毒核酸，從而獲得了針對病毒的免疫力。且隨著時間的推移建立起可遺傳的編碼免疫力。與此同時，病毒也不斷在改變逃避策略，來繞開 CRISPR 系統(tǒng)。

于是，在生命進(jìn)化史上，CRISPR 系統(tǒng)便成了細(xì)菌和病毒進(jìn)行斗爭產(chǎn)生的免疫武器。

CRISPR/Cas

CRISPR/Cas 系統(tǒng)——由一小段 RNA 和一種高效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 組成的系統(tǒng)。

CRISPR (Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats; 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列) 是一種抵御外源 DNA 的免疫機(jī)制。

CRISPR 主體為 CRISPR 基因座 (CRISPR Array): 由多個重復(fù)序列 (Repeats)和間隔序列 (Spacers) 組成。

圖 1. CRISPR/Cas 結(jié)構(gòu)[2]

Cas (CRISPR-associated genes; CRISPR 相關(guān)基因): 可在 CRISPR 序列左側(cè) (圖 1) 或右側(cè)。

Leader (前導(dǎo)序列): 300-500 個堿基組成，位于 CRISPR 的 5' 端，與第一個重復(fù)序列直接相連，是一段相對保守的 AT 富集區(qū)。Leader 是新插入序列的識別位點(diǎn)，也能作為啟動子，啟動 CRISPR 基因座的轉(zhuǎn)錄。有些細(xì)菌無前導(dǎo)序列，如大腸桿菌。

CRISPR/Cas9

在細(xì)菌及古細(xì)菌中，CRISPR 系統(tǒng)共分成 3 類，其中 I 類和 Ⅲ 類需要多種 CRISPR 相關(guān)蛋白 (Cas 蛋白) 共同發(fā)揮作用。而來自Streptococcus pyogenes的 Ⅱ 型系統(tǒng)只需要一種 Cas 蛋白 (Cas9) 即可發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性。因此，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、細(xì)菌、酵母、魚類及哺乳動物細(xì)胞。

CRISPR/Cas9 作用機(jī)制

第一步: 捕獲外源 DNA

圖 2. CRISPR/Cas9 操作第一步[6]

當(dāng)噬菌體等外源 DNA 入侵時，CAS1/2 復(fù)合體通常識別 3' 端含 NGG 的前間隔序列鄰近基序 (PAM) 區(qū)域。然后，前間隔序列 (Protospacer) 被剪切下來，作為間隔序列插入宿主 CRISPR 位點(diǎn)中，由重復(fù)序列隔開。PAM 序列結(jié)構(gòu)簡單，幾乎可在所有基因中找到，因此得到廣泛的應(yīng)用。

第二步: crRNA 合成

圖 3. CRISPR/Cas9 操作第二步[6]

CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄，形成前體 CRISPR RNA (pre-crRNA)，然后在 Cas9 蛋白的幫助下，被剪切成成熟的 tracrRNA-crRNA 雙鏈 RNA 。II 型 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中，這一步由 Cas9 及 RNase III 共同完成。對 pre-crRNA 的剪切需要先合成一段反式激活 crRNA (tracrRNA)。tracrRNA 中有部分堿基序列與 pre-crRNA 上的重復(fù)序列存在嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)關(guān)系。Cas9 及 RNase III 只有在 tracrRNA 與 pre-crRNA 上的重復(fù)序列配對形成雙鏈 RNA 的條件下，才能對 pre-crRNA 進(jìn)行剪切，剪切后，形成成熟的 tracrRNA-crRNA 雙鏈 RNA。tracrRNA-crRNA 雙鏈體被稱為 gRNA。Cas9 核酸酶和 gRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。

改造后的 CRISPR/Cas9 將 tracrRNA 和 crRNA 融合成一條單鏈引導(dǎo) RNA (sgRNA)。sgRNA 可以從單個質(zhì)粒表達(dá)，用于直接轉(zhuǎn)染或包裝成用于病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的顆粒。

另外，可通過與一些熒光物質(zhì)融合，來可視化活細(xì)胞中的內(nèi)源性基因組位點(diǎn)。如下圖的熒光小分子 DFHBI (HY-110250)。

圖 4. DFHBI 用于檢測 Cas 核酸酶活性[8]

第三步: 靶向干擾

圖 5. CRISPR/Cas9 操作第三步[6]

當(dāng)外源 DNA 再次進(jìn)入細(xì)胞時，Cas9 蛋白攜帶 gRNA，去識別外源 DNA 的 Protospacer (前間隔序列)，并與之結(jié)合，通過 Cas9 解旋酶和核酸酶對靶基因進(jìn)行剪切。造成靶基因 DNA 的雙鏈斷裂 (DSB)，從而達(dá)到干擾靶基因表達(dá)的目的。

Cas9 的酶切活性被激活的兩個條件:

1. 通過 crRNA 中的間隔序列與靶基因 DNA 的 Protospacer 互補(bǔ)配對。

2. Cas9 蛋白必須識別靶基因 DNA 上的 PAM 序列 NGG。

綜上，CRISPR 技術(shù)主要是利用位點(diǎn)特異 Cas 核酸酶在基因組靶位點(diǎn)處引入 DNA DSB，再經(jīng)細(xì)胞自身的非同源末端連接 (NHEJ) 或同源重組修復(fù) (HDR) 對 DSB 進(jìn)行修復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因敲除和堿基編輯等基因組遺傳修飾。 

DNA 修復(fù)

圖 6. DNA 兩種修復(fù)機(jī)制[6]

非同源末端連接 (NHEJ): 哺乳動物中很普遍，是 DNA 雙鏈斷裂的主要修復(fù)方式，多種修復(fù)酶強(qiáng)行將兩個 DNA 雙鏈斷端連接一起，是一種易錯修復(fù)，易在 DSB 位點(diǎn)出現(xiàn) DNA 堿基的缺失或者插入，引起基因編碼區(qū)閱讀框的改變。NHEJ 修復(fù)過程不依賴于同源 DNA 序列，核心成分是具有催化作用的 DNA-PK，Ku70 和 Ku80，及 DNA 連接酶 IV 等。NHEJ 不限于細(xì)胞周期的某個階段，可在細(xì)胞周期的任一時期發(fā)生。

同源重組修復(fù) (HDR): HDR 修復(fù)過程需要姐妹染色單體作為修復(fù)模板，以同源重組的方式在 DSB 處生成所需要的序列替換，實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)刪除，插入，或者基因矯正，具有準(zhǔn)確性和復(fù)雜性。而 HDR 在細(xì)胞周期的 S 和 G2 階段起作用。

在細(xì)胞內(nèi)，NHEJ 的發(fā)生率遠(yuǎn)高于 HDR，為了提高同源重組介導(dǎo)的精準(zhǔn)修復(fù)就需要提高 HDR 的發(fā)生頻率。通過抑制 NHEJ 修復(fù)途徑的發(fā)生可以提高同源重組修復(fù)的效率。

CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 NHEJ 與 HDR

CRISPR 系統(tǒng)靶向結(jié)合特異性的 DNA 序列，誘導(dǎo)靶 DNA 雙鏈發(fā)生精確切割。DSB 的產(chǎn)生刺激 DNA 損傷修復(fù)過程。提高基因組精準(zhǔn)編輯效率。

抑制 NHEJ 修復(fù)途徑相關(guān)化合物

SCR7是有效的 DNA 連接酶 IV 抑制劑，DNA 連接酶 IV 是 NHEJ 途徑中的關(guān)鍵酶。

NU7441高度選擇性的 DNA-PK 抑制劑，DNA-PK 在 NHEJ 修復(fù)中起關(guān)鍵作用。

增強(qiáng) HDR 修復(fù)途徑相關(guān)化合物

RS-1HDR 激活劑，可提高 Cas9 介導(dǎo)的敲入效率。

Nocodazole細(xì)胞周期抑制劑，將細(xì)胞周期阻滯在 G1/S 期或者 G2/M 期，以提高 HDR 效率 (NHEJ 修復(fù)途徑可在細(xì)胞周期的任一時期發(fā)生，而同源重組修復(fù)途徑只在細(xì)胞周期的 S 期以及 G2 期發(fā)生)。

L755507

β3-腎上腺素能受體激動劑; 增強(qiáng) CRISPR 介導(dǎo)的 HDR 效率。

Brefeldin A蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，抑制蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn); 增強(qiáng) CRISPR 介導(dǎo)的 HDR 效率。

CRISPR 的應(yīng)用

CRISPR 技術(shù)已經(jīng)用于多種不同疾病的研究，包括遺傳性血液病鐮刀狀細(xì)胞貧血癥，萊伯氏先天性黑蒙癥，泰伊-薩克斯二氏病等?；?CRISPR/Cas 系統(tǒng)而來的高通量基因組編輯技術(shù)和低成本突變檢測方法也在禾谷類作物中不斷得到發(fā)展與應(yīng)用。

萊伯氏先天性黑蒙癥 (Leber congenitalamaurosis; LCA) 是一種由中心體蛋白 290 (CEP290) 基因突變引起的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病，由至少 18 個不同基因的突變引起。該病是遺傳性兒童失明最常見的原因。眼科基因編輯療法 AGN-151587 (EDIT-101) 已進(jìn)入 I/II 期臨床研究 NCT03872479。

AGN-151587 是一種腺相關(guān)病毒 AAV5 病毒載體，裝載了 3 個成分，包括: 由 U6 聚合酶 III 啟動子控制的 2 個指導(dǎo) RNA (gRNA) RNA-323 和 gRNA-64，以及通過光受體特異性 GRK1 啟動子表達(dá)的金黃色葡萄球菌 Cas9。

圖 7. EDIT-101 示意圖[9]

不同劑量的 AGN-151587 注射到視網(wǎng)膜下，將基因編輯系統(tǒng)遞送到感光細(xì)胞中。當(dāng)感光細(xì)胞表達(dá)基因編輯系統(tǒng)時，gRNA 指導(dǎo)的基因編輯可以消除或逆轉(zhuǎn) CEP290 基因上致病的 IVS26 突變，從而改善感光細(xì)胞功能。由于 Cas9 由光受體特異性 GRK1 啟動子控制，因此該系統(tǒng)只在感光細(xì)胞內(nèi)發(fā)生基因編輯，從而將潛在副作用最小化。CRISPR 基因編輯是永久性的，意味著可能只需要一次注入就可以終身改善視力。

Tips

CRISPR 對靶基因敲除后，可使用 qPCR Mix (HY-K0510, HY-K0511, HY-K0501, HY-K0521, HY-K0522, HY-K0523) 進(jìn)行 qPCR 檢測靶基因的mRNA 表達(dá)水平來衡量敲除效率。也可使用蛋白酶抑制劑 Cocktail (HY-K0010, HY-K0011)，RIPA 裂解液 (HY-K1001)，Protein Marker (HY-K1011) 和 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒 (HY-K1005) 進(jìn)行 Western blot 檢測靶基因的蛋白表達(dá)水平來衡量敲除效率。

CRISPR gRNA/Cas 9 質(zhì)粒載體

SpCas9 載體

來源于化膿性鏈球菌，是一種高效、精準(zhǔn)的基因編輯載體，編輯范圍大，但是不能被包裝在 AAV 病毒中用于基因治療。

當(dāng)與 gRNA 序列結(jié)合后，這些 Cas9 蛋白可在特定位點(diǎn)上進(jìn)行基因組雙鏈斷裂。因其簡捷性，特異性以及高效性，在基因組編輯中廣泛使用。SpCas9 出現(xiàn)兩個連續(xù)的 G 序列就可以進(jìn)行編輯，SaCas9 需要四個堿基組合才能編輯，這樣出現(xiàn)的頻率低。

SaCas9 載體來源于金黃色葡萄球菌，是第一個被用于基因治療研究的小型 CRISPR/Cas9 載體，編輯范圍小。SaCas9 長度比 SpCas9 小。

SaCas9 的主要優(yōu)勢是腺相關(guān)病毒 (AAV) 包裝：AAV 載體將 SpCas9 與 AAV 包裝在一起可能具有挑戰(zhàn)性。相對較小的 SaCas9 利用 AAV 載體進(jìn)行 CRISPR 基因編輯成為可能?？紤]到這一結(jié)構(gòu)的免疫原性較低，因此 SaCas9 更適合于體內(nèi)編輯應(yīng)用，如用于治療。

Tips

在進(jìn)行病毒感染實(shí)驗時，可以用含有青鏈霉素雙抗 (HY-K1006) 或其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基稀釋。

CRISPR 2.0

經(jīng)典的 CRISPR 技術(shù)無法與基因組的任意部位結(jié)合，有時甚至可能會切割錯誤的位置。且沒有關(guān)閉按鈕，可能會導(dǎo)致過量切割，產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。對此，科學(xué)家們通過一系列研究，篩選出針對 CRISPR-Cas9 的小分子抑制劑 (如 HY-136251, BRD0539 是一種 CRISPR/Cas9 小分子抑制劑，可有效抑制 SpCas9)，使得對 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)有了更有效的控制?？傊?，即使有著這樣那樣的局限性，但經(jīng)典 CRISPR 系統(tǒng)依然是生物學(xué)中非常重要的工具。

被稱為 "CRISPR 2.0" 的堿基編輯 (Base Editing)——可以進(jìn)入到細(xì)胞中選定的 DNA 位點(diǎn)，直接將一個堿基轉(zhuǎn)換為另一個堿基，而不會造成 DNA 雙鏈斷裂。

CRISPR 2.0 方法并不是要替代傳統(tǒng)的 CRISPR 基因編輯技術(shù)，而是為治療某些疾病提供其他可選的方案。

如果目標(biāo)是要插入或敲除某些 DNA 堿基，CRISPR-Cas9 這種方式還是非常有效的。如果目標(biāo)僅僅是修復(fù)某個點(diǎn)突變，堿基編輯 (CRISPR 2.0) 是一種更安全有效的方式。

歲月悠悠，唯有時間能證明 CRISPR/Cas 系統(tǒng)是不是最合適的基因編輯工具。目前還需要進(jìn)行大量的實(shí)踐，同時推進(jìn)所有這些系統(tǒng)的研究。希望在不久的將來，基因編輯技術(shù)能安全地應(yīng)用到人類疾病治療、農(nóng)作物培育等各個方面。

END