當(dāng)下以CRISPR-Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)面臨的最大問(wèn)題便是其脫靶風(fēng)險(xiǎn)。為此研究者在技術(shù)誕生初期便嘗試用各種方法分析該技術(shù)在基因組水平的脫靶情況。

2013年，F(xiàn)eng Zhang & Gang Bao團(tuán)隊(duì)和Jeffry D. Sander & J. Keith Joung團(tuán)隊(duì)通過(guò)突變sgRNA序列的不同位點(diǎn)，在sgRNA/DNA雜交鏈的不同位置引入錯(cuò)配，以檢測(cè)CRISPR系統(tǒng)對(duì)錯(cuò)配的容忍度【1,2】；David R. Liu & Jennifer A. Doudna團(tuán)隊(duì)的思路則殊途同歸，通過(guò)體外篩選策略，檢測(cè)sgRNA對(duì)攜帶有不同突變的DNA靶序列的切割，檢測(cè)CRISPR系統(tǒng)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)【3】。此時(shí)的脫靶檢測(cè)方法尚處于摸索階段，尚不具備在全基因組水平分析脫靶風(fēng)險(xiǎn)的能力。

2014-2015年，多個(gè)研究組開(kāi)發(fā)出了可在全基因組范圍內(nèi)分析脫靶風(fēng)險(xiǎn)的方法如Guide-seq、Digenome-seq以及HTGTS，其基本原理是用Cas9 sgRNP在體外條件下切割基因組，之后通過(guò)捕獲分析DNA雙鏈斷裂（DSBs）的位置判斷脫靶位點(diǎn)【4-6】。在此基礎(chǔ)上，研究者推出了相同原理的CIRCLE-seq和SITE-seq兩種方法，改善了全基因組脫靶分析的特異性和靈敏度【7,8】。到2018年，研究者更是以CIRCLE-seq為基礎(chǔ)，推出了“在體脫靶驗(yàn)證系統(tǒng)” VIVO（verification of in vivo off-targets）。該系統(tǒng)中，CRISPR-Cas9脫靶位點(diǎn)的檢測(cè)依然是檢測(cè)Cas9體外切割效應(yīng)的CIRCLE-seq，通過(guò)CIRCLE-seq發(fā)現(xiàn)了潛在脫靶位點(diǎn)后，研究者在動(dòng)物體內(nèi)分析這些潛在脫靶位點(diǎn)的突變情況【9】。因此從嚴(yán)格意義上講，該方法并不是嚴(yán)格意義上的“在體脫靶驗(yàn)證系統(tǒng)”。

2019年3月1日，中科院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝研究團(tuán)隊(duì)等與中科院遺傳發(fā)育所高彩霞研究團(tuán)隊(duì)在Science雜志上發(fā)表了兩篇研究論文，通過(guò)精巧的設(shè)計(jì)和全基因組測(cè)序?qū)RISPR/Cas9以及單堿基基因編輯系統(tǒng)在小鼠胚胎及水稻中的脫靶進(jìn)行了精準(zhǔn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)良好設(shè)計(jì)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和ABE沒(méi)有明顯的脫靶效應(yīng)，但BE3系統(tǒng)則導(dǎo)致大量的的脫靶性單核苷酸突變出現(xiàn)【10,11】（詳見(jiàn)：專(zhuān)家熱評(píng)Science丨楊輝組/高彩霞組“背靠背”首次發(fā)現(xiàn)單堿基編輯系統(tǒng)存在嚴(yán)重脫靶效應(yīng)

）。這兩篇文章沒(méi)有去嘗試預(yù)測(cè)脫靶位點(diǎn)，而是直接通過(guò)全基因組測(cè)序來(lái)無(wú)差別的分析脫靶情況。

2019年4月19日，來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校的Jacob E. Corn（現(xiàn)已入職蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院ETH Zürich）在Science上發(fā)表了題為Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq 的研究成果，開(kāi)發(fā)出了全新的CRISPR-Cas9基因編輯的全基因組脫靶效應(yīng)的高效在體檢測(cè)系統(tǒng)——Discover-Seq（discovery of in situ Cas off-targets and verification by sequencing）。研究者除了在iPS細(xì)胞和小鼠模型中測(cè)試了新方法的可靠性之外，還與上文提到的VIVO系統(tǒng)進(jìn)行了對(duì)比分析，證實(shí)了新方法DISCVOER-Seq的優(yōu)越性。

DISCOVER-Seq不同于之前的方法VIVO，其對(duì)脫靶位點(diǎn)的分析并不依賴(lài)于體外切割，而是實(shí)實(shí)在在的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)。該方法的原理在于，當(dāng)Cas9在細(xì)胞內(nèi)切割基因組引入DSBs之后，細(xì)胞會(huì)通過(guò)損傷修復(fù)途徑對(duì)此加以修復(fù)，該過(guò)程中會(huì)有DNA修復(fù)蛋白結(jié)合于Cas9導(dǎo)致的DSBs位置。通過(guò)ChIP-Seq技術(shù)，研究者首先對(duì)Cas9靶位點(diǎn)處的多種DNA修復(fù)蛋白的分布進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)MRE11的分布與Cas9在靶位點(diǎn)處的切割關(guān)系最為密切?？紤]到MRE11表達(dá)的廣譜性和商用抗體的有效性，通過(guò)分析Cas9發(fā)揮作用后MRE11在基因組上的分布便可有效的檢測(cè)出潛在的脫靶位點(diǎn)（下圖）。

整個(gè)DISCOVER-Seq系統(tǒng)的檢測(cè)不需要進(jìn)行體外的基因組切割，只需要在細(xì)胞/動(dòng)物體內(nèi)的Cas9發(fā)揮作用引入DSBs后的合適窗口期，通過(guò)ChIP-Seq分析MRE11在基因組上的分布，便可以識(shí)別出脫靶位點(diǎn)。研究者首先在人源的K562細(xì)胞系和小鼠B16-F10細(xì)胞系中對(duì)新方法的有效性進(jìn)行了確認(rèn)，并與GUIDE-Seq進(jìn)行了對(duì)比，指出DISCOVER-Seq雖在靈敏性上略有不如，但在準(zhǔn)確性上較勝一籌。

之后研究者還在iPS細(xì)胞中對(duì)DISCVOER-Seq的適用性進(jìn)行了驗(yàn)證，而GUIDE-Seq由于需要轉(zhuǎn)染雙鏈DNA寡核苷酸鏈（dsODN）作為標(biāo)簽而呈現(xiàn)出細(xì)胞毒性，無(wú)法用于iPS細(xì)胞內(nèi)的脫靶分析。此處研究者選取的是CMT患者來(lái)源的iPS細(xì)胞，患者發(fā)病是由于其HSPB1基因的顯性負(fù)效應(yīng)（dominant-negative）雜合突變。研究者針對(duì)HSPB1的野生型位點(diǎn)和突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了特異性的sgRNA（WT-sgRNA vs Mut-sgRNA），并對(duì)兩種sgRNA的特異性進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞中Mut-sgRNA的特異性顯著高于WT-sgRNA。基因編輯效率分析發(fā)現(xiàn)針對(duì)WT-sgRNA在突變位點(diǎn)同樣有較高的編輯效率（~30%）；而Mut-sgRNA在野生型位點(diǎn)的突變效率顯著降低（~7%）。以上的結(jié)果證實(shí)了DISCVOER-Seq在脫靶分析上的可靠性，也表明在針對(duì)患者來(lái)源細(xì)胞的臨床前分析中DISCOVER-Seq的前景令人期待。

最后，研究者在小鼠的肝臟中針對(duì)PCSK9基因檢測(cè)了該系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，并與2018年Nature報(bào)道的VIVO系統(tǒng)進(jìn)行了對(duì)比。2018年的VIVO系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了接近3000個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，之后根據(jù)優(yōu)先級(jí)挑選的45個(gè)驗(yàn)證位點(diǎn)中，19/45有顯著的脫靶突變（發(fā)生率最低為0.13%，最高則為41.9%）。而DISCOVER-Seq系統(tǒng)則發(fā)現(xiàn)了36個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，其中27個(gè)位點(diǎn)可以被擴(kuò)增進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證，27/27均有顯著的脫靶突變（發(fā)生率最低為0.9%，最高則為78.1%）。其中17/27個(gè)位點(diǎn)并未被VIVO系統(tǒng)識(shí)別為高風(fēng)險(xiǎn)脫靶位點(diǎn)。

作者認(rèn)為，DISCOVER-Seq方法真正實(shí)現(xiàn)了在體全基因組范圍內(nèi)分析CRISPR系統(tǒng)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，且操作步驟得到了簡(jiǎn)化，在準(zhǔn)確性方面也要明顯優(yōu)于VIVO系統(tǒng)，因此在臨床應(yīng)用上或有更大的可能。

總體而言，與2018年的VIVO系統(tǒng)相比，該文在方法的創(chuàng)新性上有很大的進(jìn)步。雖然其檢測(cè)脫靶的靈敏度上或有不如，但其操作的簡(jiǎn)捷性和分析的準(zhǔn)確性上優(yōu)勢(shì)明顯，因此或更有助于推動(dòng)基因編輯從基礎(chǔ)研究到臨床的轉(zhuǎn)化。

原文鏈接：

https://science./content/364/6437/286

制版人：半夏

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