從14年 CRISPR 大規(guī)模篩選的第一篇文章以來，目前為止，影響十分以上的文章就有150篇以上。這里我們摘譯了最近發(fā)表一份關(guān)于 CRISPR/Cas9篩選在癌癥中的應(yīng)用的工作，以饗讀者。

自本世紀(jì)初大規(guī)模詳細(xì)的描述性癌癥基因組學(xué)研究，如癌癥基因組圖譜( TCGA )問世以來，世界各地的實(shí)驗(yàn)室一直在努力使這些數(shù)據(jù)變得有用。與互補(bǔ)的功能基因組數(shù)據(jù)相比，一個(gè)新的方法是基于CRISPR/Cas9的文庫篩選在細(xì)胞系中癌癥相關(guān)性狀的應(yīng)用。這樣的篩選可以揭示腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的全基因組抑制因子。在這里，描述了在細(xì)胞系中使用慢病毒文庫進(jìn)行大規(guī)模篩選。

蛋白質(zhì)編碼基因中產(chǎn)生敲除突變

CRISPR/Cas9系統(tǒng)通常用于在特定位點(diǎn)引入雙鏈DNA ( dsDNA )斷裂。dsDNA斷裂可以通過非同源末端連接( NHEJ )來修復(fù)，這是一個(gè)容易出錯(cuò)的過程，通常會(huì)在切割位點(diǎn)留下插入/刪除( in/del )突變，導(dǎo)致開放閱讀框( ORF )中的移碼突變。全基因組范圍的gRNAs文庫非常有用，其中基因組的每個(gè)基因都被多個(gè)gRNAs靶向。這些gRNAs被遞送到慢病毒載體中的細(xì)胞，在某些情況下，慢病毒載體在同一載體上表達(dá)人源化Cas9。在其他情況下，Cas9在文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)之前被遞送至細(xì)胞。將這些gRNA文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中已被用于體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化、耐藥性和體內(nèi)腫瘤形成的選擇。

篩選細(xì)胞的選擇和選擇的表型細(xì)節(jié)是成功的關(guān)鍵決定因素

所使用的細(xì)胞需要適合被慢病毒載體感染，需要易于大量生長，并且通常需要顯示研究中表型自發(fā)發(fā)展的低頻率，也就是說很少有細(xì)胞出現(xiàn)預(yù)期表型。由于相對(duì)較少的gRNAs能夠誘導(dǎo)新的表型，新現(xiàn)象類型的自發(fā)出現(xiàn)率應(yīng)該較低，否則在篩選上會(huì)觀察到許多假陽性。

另外需要考慮因素是所用細(xì)胞的倍性。那些存在于每個(gè)細(xì)胞許多表達(dá)拷貝中的基因(許多超過兩個(gè))可能不會(huì)因?yàn)榭截愄喽煌耆蕹?。也有證據(jù)表明，如果一個(gè)gRNA在一個(gè)細(xì)胞中多次切割，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這是對(duì)擴(kuò)增區(qū)域基因的關(guān)注。選擇用于研究的表型的第三個(gè)考慮是確保選擇足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。如果細(xì)胞在小鼠或其他動(dòng)物模型中受到體內(nèi)選擇性壓力，這一點(diǎn)尤為重要。當(dāng)細(xì)胞被注射到動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，許多細(xì)胞會(huì)立即死亡，因此轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體可能會(huì)經(jīng)歷群體“瓶頸”在這種情況下，并非所有的gRNAs都有機(jī)會(huì)突變其目標(biāo)基因并產(chǎn)生生物效應(yīng)。因此，對(duì)于陽性選擇方案，必須考慮正確選擇細(xì)胞系和進(jìn)行選擇分析。