https://www.toutiao.com/a6506684639690621447/僅僅數(shù)年間，使用 CRISPR（規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)）/ Cas9 進(jìn)行基因組編輯在科研上激起了巨浪，該技術(shù)使研究人員能夠精確而方便地編輯特定的基因。然而，新技術(shù)也存在一些缺點，例如在錯誤的地點切割 DNA，甚至是隨機(jī)地進(jìn)行 DNA 編輯。

但是科學(xué)家們很快開始將 CRISPR 拉回了正確的軌道，如今創(chuàng)新性的分子特性使它更好地作用并能用于更多類型的細(xì)胞。CRISPR 應(yīng)用的迅速出現(xiàn)意味著艾滋病、癌癥、鐮狀細(xì)胞病等其他疾病的臨床試驗出現(xiàn)了端倪。

今天的 CRISPR 技術(shù)對于更多研究者來說也是一個尖端的工具，與其他基因調(diào)控方法相比，更適應(yīng)于未來的醫(yī)療應(yīng)用?！盎氐?RNA 干擾（RNAi）時代，感覺就像進(jìn)入了超光速飛船?！?整合 DNA 技術(shù)公司的高級副總裁和首席科學(xué)官 Mark Behlke 說，該公司提供 RNAi 和 CRISPR 的試劑?！暗F(xiàn)在 CRISPR 使它看起來像一個孩子的游戲，實在令人驚訝?！?/p>

相比于其他基因編輯方法，如 TALENs（類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶）和鋅指核酸酶， CRISPR 更加快捷便宜，也更易于使用，從而快速地被許多領(lǐng)域的科學(xué)家所接受。例如，癌癥研究人員將包含編碼 CRISPR 向?qū)?RNA（guide RNA）和 Cas9 （CRISPR 關(guān)聯(lián)蛋白 9）的質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入細(xì)胞系中，創(chuàng)造出對應(yīng)不同研究的癌細(xì)胞系。

然而斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院副教授，兒科醫(yī)生 Matt Porteus 對于 CRISPR 起初有著不同的體驗。他說，“每個人都表示 CRISPR 會幫助解決世界上的所有問題，但當(dāng)我們試圖將細(xì)胞中的 CRISPR DNA 質(zhì)粒應(yīng)用在我們認(rèn)為重要的治療中，如造血細(xì)胞系或其他原代人類細(xì)胞類型，該系統(tǒng)根本不起作用。” 因此，Proteus 實驗室研制出的一種在人原代細(xì)胞中進(jìn)行 CRISPR/Cas9 編輯的不同遞呈方法， 完全不需要 DNA 質(zhì)粒。

該方法的變化在于通過核糖核蛋白（RNPs）形式將 CRISPR/Cas9 試劑引入細(xì)胞?！把芯咳藛T將這些試劑（gRNA 和 Cas9 蛋白）組合起來，給它們 5 到 10 分鐘的時間形成復(fù)合體，從而合成出 RNPs?！?賽默飛世爾公司合成生物學(xué)研發(fā)部高級主管 Jon Chesnut 說，“CRISPR RNPs 可通過脂質(zhì)納米粒子或電穿孔的方式傳遞到細(xì)胞中?！?/p>

雖然 RNP 試劑已被廣泛使用，但近些年研究人員對它們的興趣還停留在 CRISPR 方法的層面?！斑@是由于早期基于質(zhì)粒的方法中有大量的 DNA 工具被廣泛接受，大家還存在意識的盲區(qū)?！?Dharmacon 公司（GE 醫(yī)療集團(tuán)的子公司）高級產(chǎn)品經(jīng)理 Louise Baskin 說。與質(zhì)粒載體方法相比，無 DNA 的、基于 RNP 的 CRISPR 方法的好處在于沒有意外 DNA 的插入，能夠降低毒性，對目標(biāo)效果更好，并且提高了特異性。

這些優(yōu)點使得無 DNA 的 CRISPR 工具更適合于在治療中應(yīng)用?！皩ξ覀儊碚f，在原代組織和原代細(xì)胞類型中的基因編輯能力是一個巨大的突破。” 加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）細(xì)胞與分子藥理學(xué)博士后 Judd Hultquist 說。

通過與 Kathrin Schumann（UCSF 醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)和免疫學(xué)博士后）合作，Hultquist 將 Dharmacon 公司 Edit-R 合成 gRNAs 的 RNPs 用在人原發(fā)性 T 細(xì)胞中，該細(xì)胞是艾滋病病毒的主要目標(biāo)?，F(xiàn)在他們正在開發(fā)一種基于 RNP 的平臺，目標(biāo)在于尋找能夠提高 T 細(xì)胞對 HIV 感染抗性的遺傳變化。

CRISPR 的核糖核蛋白的使用也徹底變革了模式動物系統(tǒng)（例如秀麗線蟲）。對于秀麗線蟲而言，CRISPR 是一個真正的游戲改變者?！?華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所副教授 Brian Kraemer 說，他是 IDT 公司的無 DNA CRISPR 試劑的使用者。

將核糖核蛋白注入到線蟲性腺區(qū)，可以進(jìn)行生殖細(xì)胞的基因組編輯，隨后可以分離出具有編輯表型的后代進(jìn)行后續(xù)研究。Kraemer 的實驗室利用線蟲作為模式去識別蛋白質(zhì)聚集疾?。ㄈ缋夏臧V呆癥和肌萎縮性側(cè)索硬化癥）的致病機(jī)制所需要的基因。

Kraemer 認(rèn)為，新的 CRISPR 工具將引燃下一代線蟲轉(zhuǎn)基因模型，包括定制等位基因，依照實驗的目的而改變基因編碼蛋白，例如通過改變胞內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白的靶序列，可以使它定位到一個不同的細(xì)胞膜區(qū)域。

提高原代細(xì)胞（也包括其他細(xì)胞）CRISPR 的關(guān)鍵之一，是近期的增強(qiáng)試劑。IDT 公司開發(fā)了經(jīng)過化學(xué)修飾的能夠在胞內(nèi)抵抗核酸酶降解的 gRNA。該公司還開發(fā)了兩個短的 RNA 形式的 gRNAs（就像在原初細(xì)菌系統(tǒng)中），能夠形成復(fù)合體，而不是單一的、更長的 gRNA。MilliporeSigma 公司也計劃提供稱為 “SygRNAs” 的兩部合成 gRNAs。

牛津大學(xué)威廉鄧恩爵士病理學(xué)院的基因組工程平臺負(fù)責(zé)人 Joey Riepsaame，采用 IDT 公司的 Alt-R CRISPR/Cas9 RNP 系統(tǒng)來輔助進(jìn)行基因編輯實驗。Riepsaame 稱贊 IDT 公司的兩步合成 gRNAs，能夠減少誘發(fā)不必要的免疫反應(yīng)?！斑@對我來說是一個非常重要的因素，因為我的項目涉及到使用 CRISPR/Cas9 糾正免疫細(xì)胞中疾病誘發(fā)的突變。” 他說，“到目前為止，我們還沒有在 CRISPR/Cas9 中遇到任何重大的挑戰(zhàn)，并且能夠靶向到每個感興趣的區(qū)域?！?/p>

優(yōu)化的 CRISPR 試劑，如 RNPs 也給研究人員提供新的機(jī)會。以 DNA 為基礎(chǔ)的 CRISPR（甚至 Cas9 的信使 RNA）的一個問題，是在開始編輯前存在一個滯后階段，這期間細(xì)胞機(jī)制會轉(zhuǎn)錄和 / 或翻譯活性 CRISPR 試劑。例如，將基于 DNA 或 mRNA 的 CRISPR 試劑注射進(jìn)胚胎中時，結(jié)果能夠產(chǎn)生一種稱為 “鑲嵌體”，也就是具有超過一種的遺傳信息的動物。“RNP 的方法能夠降低鑲嵌現(xiàn)象，因為它的試劑在引入的同時就被激活，在編輯后快速降解，同時對于降低脫靶效應(yīng)也有好處。” IDT 公司的 Behlke 說。

其他的新工具，包括用于將 CRISPR 試劑更好的傳遞到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染試劑。MTI-GlobalStem 公司新的 EditPro 干細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑能夠?qū)?CRISPR 工具傳遞到細(xì)胞中，而他們的 EditPro 轉(zhuǎn)染試劑能夠傳遞進(jìn)人類原代細(xì)胞以及細(xì)胞系?！靶碌?EditPro 轉(zhuǎn)染試劑依照 mRNA 的量，具有廣泛的可調(diào)節(jié)劑量?！盡TI globalstem 公司科學(xué)總監(jiān) James Kehler 說

除了優(yōu)化 CRISPR 試劑，研究人員也正在以新的、創(chuàng)造性的方式來使用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。例如，去除 “剪刀” 功能的 Cas9 變成一種有效的分子靶向的工具，可以將附加效應(yīng)分子靶向到基因組的特定區(qū)域。不同的效應(yīng)分子，如激活子、抑制子或者修飾子也已經(jīng)被研究。MilliporeSigma 公司的 dCas9-p300 激活子就是一個融合了 p300 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的非切割版本的 Cas9。一經(jīng)結(jié)合，該激活子能夠使附近的組蛋白乙酰化，為增強(qiáng)和持續(xù)的基因表達(dá)打開了染色質(zhì)。

盡管基于 RNP 的 CRISPR 技術(shù)在近期大獲成功，在用于功能篩選時，基于質(zhì)粒技術(shù)還是存在一席之地。為了鑒定引發(fā)疾病的基因，一些公司提供了基于慢病毒 CRISPR 的基因敲除文庫。美國西北大學(xué)費因伯格醫(yī)學(xué)院小兒神經(jīng)外科副教授 Simone Treiger Sredni 近期利用賽默飛世爾科技公司的 LentiArray CRISPR 文庫去篩選 160 種影響細(xì)胞增殖的激酶的突變。Sredni 研究主要集中在尋找與兒童非典型畸胎樣 / 橫紋肌樣瘤（atypical teratoid/rhabdoid tumors ，AT/RTs) 的治療方案，這是一種侵入性和致死類型的兒童腦瘤。

Sredni 在一些特定的激酶中篩選了一致的突變，能夠減少 AT/RT 細(xì)胞系的細(xì)胞增殖。她說，“其中一種激酶的抑制劑能夠與缺失基因產(chǎn)生同樣的效應(yīng)，使得腫瘤不再生長。” 她也觀察了利用高通量的基因表達(dá)平臺進(jìn)行的篩選，“這個基因從此不起作用了，因為它的表達(dá)水平是非常低的?！?接下來，Sredni 將研究抑制劑在小鼠移植瘤中的效應(yīng)。

MilliporeSigma 公司還提供了基于慢病毒的，用于全基因組篩選 CRISPR 工具。通過與惠康基金會桑格研究所合作，MilliporeSigma 最近還為人類和小鼠的基因組構(gòu)建了陣列式的全基因組 CRISPR 文庫的，提供的格式、傳遞方式和范圍（即單基因、基因家族，或整個基因組）都很靈活。

安捷倫公司日前也發(fā)布了集合性 CRISPR 篩選指導(dǎo)庫，包括通過慢病毒載體傳遞的 CRISPR 基因敲除文庫，包括了人類和小鼠的基因組尺度。為了獲取充分的靈活性，安捷倫還提供了前擴(kuò)增和不擴(kuò)增的用戶定制文庫?！拔覀兊?CRISPR 集合庫利用 CRISPR/Cas9 在整個基因組上進(jìn)行敲除，在功能篩選中被廣泛使用?！卑步輦惞痉肿雍秃铣山M診斷和基因組生物學(xué)全球營銷總監(jiān) Caroline Tsou 說，“通常這種敲除用來確定參與的細(xì)胞反應(yīng)的基因，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或發(fā)現(xiàn)新基因的功能?！卑步輦愡€提供長達(dá) 230 個堿基對的定制化的寡核苷酸，能給研究者 “探索文庫其他用途的自由?！?她說。

但有時當(dāng)細(xì)胞在被迫表達(dá)細(xì)菌核酸酶時，狀態(tài)都不是太好。Dharmacon 公司的 Edit-R 誘導(dǎo)慢病毒 Cas9 系統(tǒng)對于那些不愿意在穩(wěn)定細(xì)胞系中長時間含有核酸酶的研究人員來說，是 “一個很好的妥協(xié)?！?巴斯金說?！罢T導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮了最好的一面，因為當(dāng)準(zhǔn)備使用向?qū)?RNA 處理細(xì)胞時，他們可以開啟核酸酶的表達(dá)，得到充分表達(dá)的 Cas9，隨后在完成切割后再將它關(guān)閉?！?/p>

與此同時，各種各樣的 CRISPR 試劑已經(jīng)為了對抗疾病準(zhǔn)備就緒，特別是使用無 DNA 的方法。比如，RNP 方法的快開、快關(guān)的特性非常適合治療性應(yīng)用，CRISPR 試劑可以定向切割隨后迅速降解。

但是糾正基因缺陷并不像敲除基因那么容易，因為通常行使功能的基因也必須被引入到正確的位置上。位于斯坦福的 Porteus 實驗室最近發(fā)表了概念驗證的 CRISPR RNPs，用于靶向β- 球蛋白基因，該基因的突變導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞病。他們發(fā)現(xiàn) CRISPR 可以修正這種疾病患者的人類造血干細(xì)胞中的β- 珠蛋白基因缺陷。此外，在加州大學(xué)伯克利分校的一個實驗室獨立地完成了一個類似的 CRISPR 編輯β珠蛋白基因的結(jié)果，使用稍微不同的方法來進(jìn)行基因修正。

綜合起來，這些工作給即將進(jìn)行的人體臨床試驗帶來了福音。2016 年 6 月，美國國立衛(wèi)生研究院在美國批準(zhǔn)的第一個臨床試驗，將使用 CRISPR 編輯人類 T 細(xì)胞幫助改善癌癥治療，預(yù)計該實驗要持續(xù)到 2017 年。

同時，Porteus 實驗室正在著手將 CRISPR 編輯的細(xì)胞用在病人身上，他們期望能在 2018 年開始臨床試驗。他們可能首先針對鐮狀細(xì)胞病，其次是嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷（SCID）。Porteus 實驗室不僅希望利用 CRISPR 修正突變，同時能夠給細(xì)胞增加新的特性，從而可以治療疾病，“例如抗 HIV 的免疫系統(tǒng)，或創(chuàng)建能夠傳遞蛋白質(zhì)到腦部的細(xì)胞?！?他說?！霸诳茖W(xué)和醫(yī)學(xué)的生態(tài)鏈中，我們覺得自己的角色應(yīng)該是將這些技術(shù)帶給病人?！?/p>

隨著 CRISPR 研究工具的飛速發(fā)展，以及將于近期開始的臨床試驗，我們與目標(biāo)的距離可能比想象中更近。