基因成千上萬(wàn)種的變異方式增加了個(gè)體受神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重紊亂影響的風(fēng)險(xiǎn)，例如：出現(xiàn)大腦發(fā)育不良^1-3。了解這些基因變異所產(chǎn)生的影響，可以揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)還有助于發(fā)現(xiàn)可能存在的新的藥物靶點(diǎn)。但是單獨(dú)對(duì)每種基因變異進(jìn)行研究是一個(gè)緩慢且艱難的過(guò)程。

除此之外，人類大腦的復(fù)雜性也使得此類研究的進(jìn)行變得愈發(fā)困難。Esk等人⁴在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了一篇論文，文章中概述了一種被稱為高通量體外篩選的方法，此種方法有望克服上述研究阻礙。隨后，作者利用他們所描述的這種篩選技術(shù)，對(duì)一種被稱作小頭畸形癥的罕見發(fā)育狀況的相關(guān)基因進(jìn)行了分析。

患有小頭畸形癥患者的大腦——特別是大腦的外部，即大腦皮層——比普通大腦要小得多^1-3。之所以出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象原因有二，由于神經(jīng)干細(xì)胞增殖的減少或是由于大腦發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞死亡的增加。小頭畸形癥常伴隨著一系列的基因和遺傳綜合征^1-3。

若要確定這些基因是否確實(shí)與小頭畸形癥有關(guān)，需要用到高通量技術(shù)，但是現(xiàn)有的篩選方法有其局限性。舉例來(lái)講，那些使用動(dòng)物來(lái)驗(yàn)證效果的高通量技術(shù)研究可能是存在問(wèn)題的，因?yàn)?/span>在不同的動(dòng)物模型中，等效基因突變可能會(huì)產(chǎn)生不同的影響⁵，并且與神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)的基因在不同物種中的表達(dá)可能是不同的。2D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)不能完全捕捉3D組織中不同類型神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的交互作用等過(guò)程，而這些過(guò)程對(duì)于正常細(xì)胞的增殖來(lái)講至關(guān)重要。

但是被稱為類器官的3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可以通過(guò)干細(xì)胞生成類似大腦的結(jié)構(gòu)，這也為克服使用動(dòng)物模型和2D細(xì)胞培養(yǎng)所面臨的問(wèn)題提供了一種強(qiáng)有力解決方案⁶。類器官會(huì)形成類似大腦的組織，可以重現(xiàn)人類從妊娠早期到中期皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵細(xì)胞和基因的表達(dá)特征^6，7。

然而，以3D形式模擬復(fù)雜組織對(duì)于高通量篩選來(lái)講是一把雙刃劍。不同細(xì)胞群生長(zhǎng)速率的可變性，使得我們難以確定細(xì)胞存活或增殖所存在的差異是由于實(shí)驗(yàn)的性質(zhì)還是由于類器官固有的變異性。

Esk等人試圖通過(guò)將腦類器官與一種基于基因編輯的新技術(shù)CRISPR-Cas9相結(jié)合的方法，來(lái)克服上述問(wèn)題。在CRISPR-Cas9技術(shù)中，引導(dǎo)性RNA（gRNA）被設(shè)計(jì)成能夠與即將被編輯的DNA序列結(jié)合的形式。Cas9酶隨后與gRNA結(jié)合并使DNA鏈斷裂。通常情況下，這種DNA鏈斷裂會(huì)被細(xì)胞錯(cuò)誤地修復(fù)，而修復(fù)的結(jié)果可能導(dǎo)致基因被“敲除”，也就是說(shuō)我們感興趣的基因將不再被翻譯成功能性蛋白質(zhì)。

Esk及其同事針對(duì)173個(gè)與小頭畸形癥有關(guān)的基因設(shè)計(jì)了相對(duì)應(yīng)的gRNA，并且使用一種稱為譜系條形碼的獨(dú)特DNA序列對(duì)每個(gè)gRNA進(jìn)行了標(biāo)記。隨后，他們用這些條形碼gRNAs感染了干細(xì)胞。每個(gè)接收到給定gRNA的細(xì)胞及其所有后代攜帶的條形碼都是相同的，這方便了我們對(duì)細(xì)胞譜系進(jìn)行識(shí)別。將干細(xì)胞在3D培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天形成一個(gè)腦類器官，隨后提取并匯集所有類器官細(xì)胞中的DNA。

篩選的目的是計(jì)算每個(gè)感興趣基因的譜系條形碼的數(shù)量，并將該數(shù)值與未發(fā)生任何基因突變的對(duì)照gRNA的譜系條形碼數(shù)量進(jìn)行比較。如果與對(duì)照gRNA譜系條形碼的數(shù)量相比，候選基因的譜系條形碼發(fā)生了損耗，則表明該基因是細(xì)胞正常增殖所必需的。但是，在分析過(guò)程中我們很難檢測(cè)到數(shù)量較少的譜系條形碼（即來(lái)自小譜系的條形碼）。這就需要我們?cè)O(shè)定更高的分辨率，從而確保能夠檢測(cè)到中度細(xì)胞丟失的情況（而中度細(xì)胞丟失這是小頭畸形癥的典型特征）。除此之外，正如上文所述，在一個(gè)3D腦類器官中，基線譜系大小的變化是非常大的。

為了解決這些問(wèn)題，Esk等人在DNA處理過(guò)程中為每個(gè)細(xì)胞添加了第二類條形碼，從而對(duì)譜系中每個(gè)細(xì)胞的DNA分別進(jìn)行了標(biāo)記（圖1）。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單個(gè)的條形碼標(biāo)記，使得研究人員能夠精確地追蹤每個(gè)譜系中究竟有多少細(xì)胞。

雙重條形碼標(biāo)記共同解釋了類器官細(xì)胞生長(zhǎng)的變異性（每個(gè)基因可以使用多個(gè)gRNAs，從而可以更可靠地檢測(cè)到細(xì)胞變異的趨勢(shì)），同時(shí)對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行條形碼標(biāo)記使得我們檢測(cè)小譜系的細(xì)胞增殖變化成為可能，這也更方便我們對(duì)基因缺失導(dǎo)致的中度細(xì)胞丟失的情況進(jìn)行識(shí)別。該研究團(tuán)隊(duì)將他們所使用的這種技術(shù)命名為，異質(zhì)組織中以細(xì)胞分辨率進(jìn)行的CRISPR譜系追蹤（CRISPR-LICHT）。

圖1 | 基因編輯和譜系追蹤方法——CRISPR-LICHT。Esk等人利用CRISPR-LICHT方法對(duì)基因突變是如何改變大腦細(xì)胞數(shù)量這一問(wèn)題進(jìn)行了分析。a、研究者設(shè)計(jì)了引導(dǎo)性RNA（gRNA）分子，每個(gè)分子與173個(gè)感興趣的基因中的一個(gè)進(jìn)行結(jié)合。并且他們使用一種被稱為譜系條形碼（LB）的獨(dú)特DNA序列對(duì)每個(gè)gRNA分子進(jìn)行了標(biāo)記。b、然后將每個(gè)gRNA包裝成慢病毒（為了看起來(lái)更簡(jiǎn)潔，這里只顯示了三個(gè)gRNA包裝成的慢病毒），并使用慢病毒池感染人類胚胎干細(xì)胞（hESCs）。c、隨后將細(xì)胞置于3D培養(yǎng)基中，并催生Cas9酶（該酶的目標(biāo)是gRNAs，它能夠使gRNAs刪除每個(gè)受感染細(xì)胞中的基因；圖中未顯示）。細(xì)胞將被培養(yǎng)至40天，從而生成復(fù)雜的3D腦類器官。有些譜系細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，而另外一些譜系則大量減少（雜交）。d、隨后對(duì)類器官進(jìn)行收集并選擇其中含有Cas9的細(xì)胞（圖中未顯示）。對(duì)這些細(xì)胞中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并添加第二種獨(dú)特的DNA條形碼（細(xì)胞條形碼，CB）。然后按照gRNA和條形碼對(duì)這些DNA進(jìn)行測(cè)序。LBs（譜系條形碼）是我們能夠精確測(cè)量每個(gè)譜系的大小，CBs（細(xì)胞條形碼）增加了我們挑選小譜系的能力。如果含有某一基因gRNAs的譜系一直很?。ㄟ@里可以參看基因2和基因3），那么該基因很可能在腦細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。（圖源：nature）

研究人員對(duì)173個(gè)被認(rèn)為引起患小頭畸形癥風(fēng)險(xiǎn)的基因進(jìn)行了譜系條形碼缺失排序，并對(duì)排名前32的基因進(jìn)行了更為詳細(xì)的檢驗(yàn)。他們利用混合策略研究了這32個(gè)基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中所發(fā)揮的作用，該混合策略指的是，他們從控制細(xì)胞和經(jīng)過(guò)基因編輯缺失了某一基因的細(xì)胞結(jié)合體中培養(yǎng)出類器官，并分析了完全長(zhǎng)成的類器官中控制細(xì)胞與編輯細(xì)胞的比率。如果發(fā)現(xiàn)編輯過(guò)的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，則表明基因缺失導(dǎo)致了細(xì)胞增殖的減少。在被研究的32個(gè)基因中，有25個(gè)被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞增殖有關(guān)。

最終，Esk等人集中研究了該基因集合中的一個(gè)特定基因，該基因主要負(fù)責(zé)的是編碼即時(shí)早期反應(yīng)3相互作用蛋白1（IER3IP1）。當(dāng)細(xì)胞被敲除該基因時(shí)，產(chǎn)生的類器官比對(duì)照類器官小。對(duì)缺乏這種基因的類器官的分析結(jié)果表明，該基因似乎是用來(lái)調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)的（即細(xì)胞內(nèi)一種稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞器對(duì)壓力的反應(yīng)，這種反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的減少）。

使用一種能夠恢復(fù)蛋白質(zhì)合成的被稱為整合應(yīng)激反應(yīng)抑制劑的小分子對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，會(huì)使類器官中神經(jīng)前體細(xì)胞的大小和組織恢復(fù)正常。這些發(fā)現(xiàn)是非常有趣的，因?yàn)樗鼈儗毫?/span>誘導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)（該反應(yīng)此前被認(rèn)為與Zika病毒相關(guān)的小頭畸形癥⁸有關(guān)）與患有疾病的遺傳因素聯(lián)系在一起。這些實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了CRISPR-LICHT技術(shù)在研究神經(jīng)發(fā)育障礙的機(jī)制方面的巨大潛力。

盡管Esk及其同事在研究中主要關(guān)注的是與小頭畸形癥相關(guān)的基因，但是他們所使用的高性價(jià)比且省時(shí)的方法將廣泛適用于其他神經(jīng)發(fā)育障礙。發(fā)育性腦部疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)(go.nature.com/3mezn8d)列出了約600個(gè)基因，這些基因的缺失與自閉癥、精神分裂癥和癲癇癥等神經(jīng)發(fā)育性障礙有關(guān)。現(xiàn)在，這些基因都可以通過(guò)CRISPR-LICHT技術(shù)篩選出來(lái)。

這種方法也可以通過(guò)調(diào)整基因來(lái)改變而不是消除基因表達(dá)，從而對(duì)神經(jīng)發(fā)育障礙中低表達(dá)或過(guò)度表達(dá)的基因進(jìn)行研究。除此之外，CRISPR-LICHT技術(shù)中所使用的雙條形碼技術(shù)也可以被用于創(chuàng)建和跟蹤在遺傳上有所區(qū)別的細(xì)胞群體，從而模擬大腦發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞間遺傳變異所產(chǎn)生的影響⁹。最后，這種方法可用于分析與癌癥相關(guān)的基因。

但是，這一方法也存在一定的局限性。CRISPR-LICHT技術(shù)最適用于與早期發(fā)育或細(xì)胞增殖相關(guān)的研究。本研究中的大腦類器官的生長(zhǎng)時(shí)間為40天，這模擬的是人類在妊娠早期的大腦發(fā)育，因此沒有考慮后期發(fā)育成熟的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。使用更長(zhǎng)的分化時(shí)間，將會(huì)使周轉(zhuǎn)期增加。

除此之外，當(dāng)前的類器官生成方案可能激活細(xì)胞的應(yīng)激路徑，從而損害細(xì)胞類型規(guī)格及其準(zhǔn)確性¹⁰。最后，并不是所有的皮層都是一樣的，不同的皮層區(qū)域有不同的細(xì)胞類型和連接，起著不同的作用。我們需要設(shè)計(jì)出更為精確的方案來(lái)對(duì)這種復(fù)雜性和區(qū)域化進(jìn)行模擬。

除臨床研究外，CRISPR-LICHT平臺(tái)還可用于研究健康人腦進(jìn)化過(guò)程中的遺傳變化及機(jī)制。有證據(jù)表明，人類皮層的擴(kuò)張和折疊取決于人類早期神經(jīng)元發(fā)育的特性^11-13。使用大腦類器官來(lái)篩選人類特有的或者在人類中表現(xiàn)出獨(dú)特活動(dòng)模式的基因和其他DNA元素¹⁴，這可能是在人類神經(jīng)發(fā)育的背景下，將基因與人類特征聯(lián)系起來(lái)的一種強(qiáng)有力的方法。

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