相較于傳統(tǒng)的臨床微生物的檢測(cè)方法，mNGS不僅有效提高了病原微生物的檢出率，也彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，特別是在某些疑難重癥感染性疾病的精準(zhǔn)診療中發(fā)揮著重要作用。隨著近年來(lái)mNGS相關(guān)應(yīng)用規(guī)范及專(zhuān)家共識(shí)的相繼出臺(tái)，如何利用現(xiàn)有的新興檢測(cè)手段完善目前的臨床診療路徑，提高對(duì)疾病的診斷效率，是檢驗(yàn)科和臨床都亟待思考的問(wèn)題。

關(guān)于mNGS有很多需要深入探討的問(wèn)題。本期邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)多位檢驗(yàn)與臨床的一線(xiàn)專(zhuān)家對(duì)mNGS的相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行了深度探討，同時(shí)也對(duì)mNGS未來(lái)的發(fā)展提出了展望。

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mNGS在檢驗(yàn)與臨床中的應(yīng)用

卓超教授：

mNGS是一種不需要培養(yǎng)，不需要前提假設(shè)，從臨床樣品中提取核酸，利用基因組學(xué)的方法研究樣品中所有微生物的種類(lèi)和含量的技術(shù)。mNGS檢測(cè)中的Reads指的是匹配到該病原體的序列數(shù)目，其多少與標(biāo)本中病原體本身載量負(fù)荷、核酸提取量、人源序列比例有關(guān)。

許建成教授：

當(dāng)出現(xiàn)以下臨床適應(yīng)證：（1）不明原因發(fā)熱或發(fā)熱癥候群；（2）急危重癥不除外感染；（3）免疫受損疑似繼發(fā)感染；（4）疑似局部感染，病原學(xué)診斷未明確、不及時(shí)處理則后果嚴(yán)重；（5）高度疑似感染性疾病，常規(guī)抗感染治療無(wú)效；（6）慢性感染或慢性疾病不除外感染；（7）食物中毒、溺水、旅游、特殊環(huán)境(不除外感染性疾病)，建議在行常規(guī)手段檢測(cè)的同時(shí)開(kāi)展mNGS。但mNGS不適用于評(píng)估抗感染治療效果，以及常規(guī)微生物檢查容易明確病原體的感染。

當(dāng)出現(xiàn)以下微生物學(xué)適應(yīng)證：（1）出現(xiàn)疑似新發(fā)病原體或某特殊病原體；（2）傳統(tǒng)檢測(cè)手段無(wú)法檢出微生物但確有微生物感染指征；（3）考慮多病原感染，傳統(tǒng)技術(shù)手段只能明確其中一部分，建議常規(guī)手段檢測(cè)的同時(shí)開(kāi)展mNGS。感染性疾病已明確病原體或考慮某病原體，需知曉毒力因子相關(guān)信息時(shí)，可考慮行mNGS物種鑒定聯(lián)合mNGS檢測(cè)毒力基因。

當(dāng)正常有微生物部位疑似感染，或正常無(wú)微生物部位疑似感染但標(biāo)本有污染時(shí)，不建議采用mNGS進(jìn)行耐藥性檢測(cè)；正常無(wú)微生物部位疑似感染且標(biāo)本采集過(guò)程污染概率低，考慮采用mNGS進(jìn)行物種鑒定的同時(shí)檢測(cè)耐藥基因；有菌種特異性的耐藥性基因的檢測(cè)考慮mNGS檢測(cè)耐藥基因，預(yù)測(cè)耐藥表型。

當(dāng)疑似出現(xiàn)聚集性事件或暴發(fā)事件時(shí)，考慮微生物導(dǎo)致感染性疾病，或去過(guò)特殊區(qū)域或有特殊工作史，病因未明的感染性疾病，建議常規(guī)手段檢測(cè)的同時(shí)開(kāi)展mNGS。

許建成教授：

標(biāo)本采集的基本要求：（1）標(biāo)本應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌采集，避免污染；（2）標(biāo)本應(yīng)添加核酸穩(wěn)定劑；（3）標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程須防污染、冷鏈快速運(yùn)送；（4）標(biāo)本不能及時(shí)檢測(cè)時(shí)，應(yīng)保存于低于-80℃冰箱或液氮。不同類(lèi)型標(biāo)本采集要求見(jiàn)圖1［3］。

注：A為一般類(lèi)型、無(wú)菌標(biāo)本標(biāo)本采集要求，B為呼吸系統(tǒng)標(biāo)本采集要求。

圖1  標(biāo)本采集要求

標(biāo)本長(zhǎng)期保存的原則：（1）用于DNA測(cè)序的標(biāo)本在-20℃保存不超過(guò)7 d；（2）用于RNA測(cè)序的標(biāo)本應(yīng)在-80℃保存；（3）避免標(biāo)本反復(fù)凍融，一般不超過(guò)3次；（4）理論上-80℃可長(zhǎng)期保存；（5）懷疑高致病性或新發(fā)、突發(fā)傳染病，須遵循國(guó)際“通用生物安全標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)要求”包裝及轉(zhuǎn)運(yùn)要求，盡可能在生物安全條件下提取核酸后再運(yùn)送標(biāo)本。

核酸提取的基本要求：（1）建立經(jīng)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)化核酸提取流程；（2）選擇經(jīng)驗(yàn)證的病原體核酸提取試劑盒進(jìn)行提取，應(yīng)驗(yàn)證細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等核酸提取效能，應(yīng)保證病毒核酸提取完整性，胞壁較厚病原體應(yīng)采取常規(guī)法以外的破壁方法或以游離核酸（cell free核酸）為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)；（3）高宿主背景標(biāo)本提取時(shí)可采用經(jīng)驗(yàn)證方法去除宿主細(xì)胞，如使用去污劑、低滲溶液、抗甲基化DNA磁珠、基因編輯技術(shù)剝離目標(biāo)序列或在提升檢測(cè)靈敏度基礎(chǔ)上選擇cell free核酸進(jìn)行病原檢測(cè)，更大程度降低人源干擾，提升檢測(cè)準(zhǔn)確性；（4）提取過(guò)程應(yīng)有防污染措施，包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

建庫(kù)的基本要求：（1）采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的流程進(jìn)行建庫(kù)；（2）建庫(kù)慎用各種擴(kuò)增方法，因擴(kuò)增會(huì)使正常菌群或污染病原體序列擴(kuò)大，導(dǎo)致真正病原體判斷困難。

建庫(kù)的主要內(nèi)容包括：（1）制備DNA文庫(kù)：包括末端修復(fù)、連接接頭、PCR富集、純化、克隆生成等過(guò)程；（2）制備RNA文庫(kù)：包括去除核糖體、反轉(zhuǎn)錄及雜交、片段化、第一/二鏈合成、末端修復(fù)、連接接頭、PCR富集、純化、克隆生成等環(huán)節(jié)；（3）明確核酸質(zhì)量(純度、濃度)及文庫(kù)產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)(文庫(kù)濃度、片段大小)；（4）評(píng)估外源核酸污染。

測(cè)序的基本要求：（1）采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的流程進(jìn)行測(cè)序；（2）測(cè)序原始數(shù)據(jù)應(yīng)進(jìn)行質(zhì)控，并且過(guò)濾掉低復(fù)雜度、低質(zhì)量的序列，確保測(cè)序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量；（3）標(biāo)本允許情況下，優(yōu)先進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)和測(cè)序。在測(cè)序過(guò)程中，需要注意以下幾點(diǎn)：①不同測(cè)序平臺(tái)可能會(huì)產(chǎn)生不同類(lèi)型讀長(zhǎng)；②測(cè)序平臺(tái)錯(cuò)誤率不同，錯(cuò)誤讀取堿基的概率不同；③測(cè)序儀在處理具有大的均聚物重復(fù)序列、富含GC、結(jié)構(gòu)重復(fù)以及基因組其他復(fù)雜區(qū)域標(biāo)本時(shí)，常會(huì)錯(cuò)誤讀取堿基；④不同標(biāo)本測(cè)序深度需求不同，主要由不同標(biāo)本宿主背景比例、微生物多樣性決定，其次是不同測(cè)序平臺(tái)和測(cè)序成本影響。

生物信息學(xué)分析流程應(yīng)經(jīng)性能確認(rèn)和驗(yàn)證，包括數(shù)據(jù)庫(kù)優(yōu)化、比對(duì)方法和比對(duì)參數(shù)的優(yōu)化等，確保準(zhǔn)確報(bào)告致病病原體。

余方友教授：

對(duì)于序列數(shù)的多少才有意義的問(wèn)題目前沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)定。從采集的標(biāo)本中獲得的結(jié)核分枝桿菌，無(wú)論序列數(shù)多少，應(yīng)慎重對(duì)待這些結(jié)果，結(jié)合臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特征可考慮為病原菌的可能，但也應(yīng)考慮假陽(yáng)性的可能。而非結(jié)核分枝桿菌在環(huán)境中大量存在，因此若檢出非結(jié)核分枝桿菌，需要結(jié)合臨床來(lái)判斷其致病性。對(duì)于分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌等破壁困難的微生物而言，可能提取出的DNA很少，因此即使序列數(shù)很低，也應(yīng)考慮為致病菌。但對(duì)于這類(lèi)微生物的陰性預(yù)測(cè)值則需要謹(jǐn)慎考慮，可能因破壁困難，DNA沒(méi)有被成功提取，從而導(dǎo)致假陰性的情況。因此需要進(jìn)一步結(jié)合臨床，并尋找輔助實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證以確認(rèn)其致病性。

許建成教授：

mNGS能否準(zhǔn)確鑒定定植或感染病原體，目前難有定論。傳統(tǒng)檢測(cè)方式，比如痰標(biāo)本培養(yǎng)，根據(jù)行標(biāo)或共識(shí)容易判斷定植或感染病原體，但是mNGS檢測(cè)的病原體種類(lèi)繁多，許多未知病原體，在數(shù)據(jù)庫(kù)或文獻(xiàn)中很難查到相關(guān)信息，此時(shí)很難評(píng)估定植菌或致病菌，只能不斷積累數(shù)據(jù)，綜合評(píng)估。

臨床醫(yī)生是感染性疾病診治的執(zhí)行者，經(jīng)過(guò)臨床醫(yī)生的診療實(shí)踐，才能確認(rèn)mNGS報(bào)告的病原體是否有價(jià)值、患者是否需要治療、治療是否有效等。所以對(duì)來(lái)自呼吸道、消化道、生殖道等正常有微生物的標(biāo)本，準(zhǔn)確判斷定植或感染病原體還有很長(zhǎng)的路要走。工作中時(shí)常會(huì)遇到病原體檢測(cè)報(bào)告與患者病情不符的情況，如患者尚未出現(xiàn)明顯感染的臨床表現(xiàn)，但mNGS檢測(cè)卻報(bào)告出很多病原體，這時(shí)需要評(píng)估該檢測(cè)報(bào)告。mNGS檢測(cè)范圍很廣，對(duì)大部分病原體檢測(cè)準(zhǔn)確，但臨床醫(yī)生應(yīng)意識(shí)到有些病原體可能是標(biāo)本采集、核酸提取、建庫(kù)引入的污染?？傮w來(lái)講，mNGS是一項(xiàng)非常好的技術(shù)，但在區(qū)分定植菌和感染菌方面還有待進(jìn)一步探討及評(píng)估。

陳茶教授：

第1點(diǎn)，在解讀mNGS報(bào)告時(shí)應(yīng)結(jié)合不同的標(biāo)本類(lèi)型及檢出病原微生物的種類(lèi)來(lái)分析，同時(shí)應(yīng)關(guān)注該標(biāo)本是來(lái)源于無(wú)菌部位還是有菌部位，即在確認(rèn)致病微生物時(shí)應(yīng)考慮微生物是否真正來(lái)源于感染部位，是否是真正的潛在病原菌。

第2點(diǎn)，從mNGS報(bào)告結(jié)果中時(shí)常會(huì)發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的、易于培養(yǎng)的病原體，對(duì)于這些病原體，建議結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，將兩種方法結(jié)合起來(lái)，有助于臨床更加準(zhǔn)確地判斷。

第3點(diǎn)，需關(guān)注核酸提取過(guò)程中破壁較困難的微生物，如分枝桿菌屬、奴卡菌、真菌（尤其是絲狀真菌）等。因?yàn)樵诔Ｒ?guī)情況下第三方公司或者實(shí)驗(yàn)室采用的方法對(duì)這些破壁困難的微生物的破壁效果可能不好，最后得出的結(jié)果可能是該類(lèi)微生物序列數(shù)較低，但我們?nèi)孕鑼⑵浼{入可能的病原微生物，并積極采用其他方法進(jìn)行驗(yàn)證，如血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等。雖然mNGS陰性結(jié)果對(duì)排除感染有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，但對(duì)于核酸提取難度大的微生物，則需要注意其漏檢的情況，即mNGS對(duì)此類(lèi)病原微生物的陰性預(yù)測(cè)價(jià)值較低。

第4點(diǎn)，不能通過(guò)不同病原微生物檢出序列數(shù)的多少來(lái)判斷其致病性的大小，即以序列數(shù)的多少來(lái)判斷誰(shuí)是致病菌誰(shuí)不是，需結(jié)合微生物種類(lèi)的差異以及致病性的特點(diǎn)來(lái)判斷。最后，mNGS報(bào)告的解讀不能僅憑結(jié)果簡(jiǎn)單地判斷，還需結(jié)合臨床癥狀，以及臨床微生物、分子生物學(xué)、影像學(xué)及感染科醫(yī)生等多學(xué)科的共同討論，來(lái)綜合判斷。

陳茶教授：

關(guān)于宏基因組測(cè)序陰性結(jié)果對(duì)于排除感染的價(jià)值問(wèn)題是目前大家非常關(guān)注的問(wèn)題。是不是宏基因組測(cè)序陰性結(jié)果一定說(shuō)明不存在感染的情況呢?實(shí)際情況并沒(méi)有那么簡(jiǎn)單。宏基因組測(cè)序陰性結(jié)果在大多數(shù)情況下可以排除微生物感染的存在，但謹(jǐn)慎來(lái)講，其僅能說(shuō)明存在感染的可能性較低，因?yàn)閷?duì)于病原微生物數(shù)量少或核酸提取困難的微生物，宏基因組測(cè)序可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。想提高宏基因組測(cè)序陰性結(jié)果的診斷價(jià)值，關(guān)鍵在于應(yīng)注意整個(gè)過(guò)程中的環(huán)節(jié)控制，使其避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果的情況。

第1點(diǎn)，關(guān)注標(biāo)本質(zhì)量問(wèn)題。正確的檢驗(yàn)結(jié)果的前提是選擇合適的標(biāo)本類(lèi)型及采集合格的標(biāo)本。注意無(wú)菌操作，避免人為的污染。另外，標(biāo)本保存、運(yùn)輸條件都非常關(guān)鍵。

第2點(diǎn)，優(yōu)化核酸提取流程。核酸提取過(guò)程中的任何環(huán)節(jié)都可能會(huì)影響到檢驗(yàn)結(jié)果，如果臨床已提示可能存在胞內(nèi)菌、結(jié)核分枝桿菌、真菌等感染，則更應(yīng)當(dāng)關(guān)注標(biāo)本的前期處理等過(guò)程。每批樣品都需做陰性或者陽(yáng)性質(zhì)控，監(jiān)控好每個(gè)質(zhì)量環(huán)節(jié)，這有助于提高病原微生物的檢出。在工作中，若遇到宏基因組測(cè)序呈陰性結(jié)果，但采用顯微鏡法等傳統(tǒng)檢測(cè)方法測(cè)出病原體的情況，提示在宏基因組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程，如前期核酸提取等步驟需要優(yōu)化。

第3點(diǎn)，完善數(shù)據(jù)庫(kù)。若數(shù)據(jù)庫(kù)未及時(shí)更新完善，不包括新的或少見(jiàn)物種，也可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此不斷更新和完善數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性，對(duì)于提高病原菌的檢出率非常重要。

綜上，mNGS技術(shù)在微生物檢測(cè)方面具有較高的價(jià)值，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用過(guò)程，需要進(jìn)一步去完善，同時(shí)，要正確看待其陰性結(jié)果，不能盲目將得到的陰性結(jié)果即認(rèn)為是排除感染的依據(jù)。

許建成教授：

解讀報(bào)告應(yīng)關(guān)注的參數(shù)包括測(cè)序豐度、總序列數(shù)、特異序列數(shù)、閾值、微生物序列的數(shù)據(jù)量、測(cè)序深度、測(cè)序質(zhì)量、覆蓋度等。

mNGS檢測(cè)報(bào)告解讀的基本原則之一是分級(jí)解讀。其中，高等級(jí)條件致病菌（如結(jié)核分枝桿菌等）在大部分標(biāo)本中均可能是病原體；中等級(jí)條件致病菌（如念珠菌屬）在無(wú)菌樣本中可能為病原體，但在痰液、肺泡灌洗液等標(biāo)本中可能是共生菌；低等級(jí)條件致病菌（如凝固酶陰性葡萄球菌）在大部分樣本中為共生菌，在少數(shù)情況為致病菌。

檢測(cè)報(bào)告中的序列數(shù)通常為特異且唯一比對(duì)到某病原體基因組上的序列條數(shù)，序列數(shù)越高說(shuō)明該病原體存在的可信度越高；而同一患者的多個(gè)樣本中檢測(cè)出相同病原體，此病原體致病的可能性增加。

陰性預(yù)測(cè)值的報(bào)告解讀分以下幾類(lèi)。第一種情況是在正常菌群樣本（如痰液、肺泡灌洗液等存在微生物的樣本）中，檢測(cè)結(jié)果無(wú)病原體檢出，但存在較多疑似背景微生物，提示標(biāo)本為合格標(biāo)本，應(yīng)著重關(guān)注患者基本信息及跟進(jìn)最新臨床病情，綜合判斷，排除感染的可能性。第二種情況是在采集的樣本不能反映感染病灶情況（如肺部感染，但采集標(biāo)本為外周血）時(shí)，檢測(cè)結(jié)果和疑似背景微生物均無(wú)檢出，對(duì)于腦脊液、外周血等無(wú)菌樣本可提示排除感染；而痰液、肺泡灌洗液等存在微生物的樣本必須重新回溯檢測(cè)流程和質(zhì)控，必要時(shí)從樣本核酸提取開(kāi)始重新檢測(cè)和復(fù)核。

對(duì)罕見(jiàn)病原體、胞內(nèi)菌等特殊病原體的報(bào)告解讀困難的原因包括樣本中含量低、胞內(nèi)釋放未完全、核酸提取效率低、序列數(shù)低于報(bào)告閾值等。對(duì)罕見(jiàn)病原體的報(bào)告解讀，應(yīng)了解比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容，明確是否涵蓋少見(jiàn)病原或新發(fā)病原；結(jié)合病史并進(jìn)行臨床溝通后再報(bào)告。對(duì)胞內(nèi)、破壁困難的微生物的報(bào)告解讀，可以調(diào)整報(bào)告閾值；有時(shí)即使序列數(shù)很低，也要考慮為致病體；積極尋找輔助實(shí)驗(yàn)幫助驗(yàn)證，如特異引物PCR、一代測(cè)序、曲霉菌GM試驗(yàn)、IgG抗體等。

此外，DNA和RNA同時(shí)檢出可提示致病的可能性更高。對(duì)于重癥疾病、復(fù)發(fā)感染、不明原因發(fā)熱、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等情況，推薦48~72 h內(nèi)完成檢測(cè)并發(fā)出報(bào)告。對(duì)于常規(guī)易培養(yǎng)的病原微生物，如革蘭陽(yáng)性菌中的葡萄球菌屬、多數(shù)鏈球菌、腸球菌，革蘭陰性菌中的腸桿菌目等，傳統(tǒng)培養(yǎng)手段能給出較好結(jié)果，并非mNGS優(yōu)勢(shì)所在。血漿樣本的游離DNA進(jìn)行mNGS檢測(cè)時(shí)，應(yīng)注意檢出序列屬于致病微生物、樣本污染、死亡微生物裂解，還是定植菌群所致的一過(guò)性菌血癥。

對(duì)于不同標(biāo)本類(lèi)型的報(bào)告解讀，在確認(rèn)致病微生物時(shí)，應(yīng)考慮檢出微生物是否為感染部位的潛在病原體，注意排除常見(jiàn)定植菌、污染菌與工程菌的影響，不同標(biāo)本類(lèi)型的報(bào)告解讀見(jiàn)圖2。

注：A為無(wú)菌標(biāo)本腦脊液標(biāo)本類(lèi)型，B、C為有菌標(biāo)本呼吸道標(biāo)本類(lèi)型。

圖2  不同標(biāo)本類(lèi)型的報(bào)告解讀

mNGS檢測(cè)結(jié)果應(yīng)由一定生物信息學(xué)知識(shí)，從事臨床感染或臨床微生物等專(zhuān)業(yè)人員，結(jié)合患者臨床背景、影像學(xué)資料、其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，綜合判斷。

關(guān)鴻志教授：

臨床診療路徑的選擇需要根據(jù)不同的疾病采取不同的策略。以神經(jīng)感染性疾病為例，新英格蘭雜志一篇實(shí)驗(yàn)室學(xué)者發(fā)表的多中心腦脊液第二代測(cè)序研究中，從患者發(fā)病到使用腦脊液第二代測(cè)序的平均時(shí)間為40 d，而我們國(guó)內(nèi)神經(jīng)科醫(yī)生做了一項(xiàng)多中心研究，從患者發(fā)病到采用第二代測(cè)序的平均時(shí)間為10 d。我們當(dāng)時(shí)研究的入組標(biāo)準(zhǔn)為首次腰穿之后無(wú)法確診，若經(jīng)驗(yàn)治療無(wú)效，在第二次腰穿時(shí)取腦脊液送檢行第二代測(cè)序，或是將第一次腰穿凍存的腦脊液送檢行第二代測(cè)序，最后統(tǒng)計(jì)平均送檢時(shí)間為10 d左右，這一入組標(biāo)準(zhǔn)在當(dāng)時(shí)可以作為腦脊液第二代測(cè)序的臨床適應(yīng)癥或者推薦檢測(cè)時(shí)機(jī)。而目前臨床上從發(fā)病到進(jìn)行第二代測(cè)序的時(shí)間可能已不到一周，或者只有3~4 d。

第二代測(cè)序技術(shù)真正改變了神經(jīng)感染性疾病的診斷策略。以往的PCR檢測(cè)方法對(duì)單純皰疹性腦膜炎的確診率較低，可及性不高。盡管我們推測(cè)皰疹性腦炎是國(guó)內(nèi)成人最常見(jiàn)的病毒性腦炎類(lèi)型，但在以前的臨床上卻難以通過(guò)檢測(cè)證實(shí)。腦脊液第二代測(cè)序臨床應(yīng)用，使中國(guó)人群的病毒性腦炎病原譜得以逐漸清晰，且隨著第二代測(cè)序地廣泛應(yīng)用，單中心、多中心乃至全國(guó)的神經(jīng)感染病原體譜相關(guān)研究也越來(lái)越多。

腦脊液第二代測(cè)序作為一項(xiàng)單一病原體檢測(cè)方法，陽(yáng)性率可達(dá)到30%~40%，這是目前其他技術(shù)檢測(cè)無(wú)法匹及的。在未來(lái)，第二代測(cè)序技術(shù)隨著其可及性及成本的降低會(huì)被越來(lái)越廣泛應(yīng)用，而成為一種一線(xiàn)檢測(cè)方法。目前，對(duì)于病因不明的腦炎患者，我們首先選擇可及性更高的一線(xiàn)檢測(cè)方法，但如果一線(xiàn)檢測(cè)方法無(wú)法得出有效的鑒別診斷結(jié)果，則需進(jìn)行第二代測(cè)序，或者對(duì)于特殊類(lèi)型的腦炎，或重癥腦炎，采用傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)可能無(wú)法得出可靠結(jié)果時(shí)，可采用第二代測(cè)序。第二代測(cè)序?qū)Φ洼d量病毒靈敏度較高，覆蓋度很廣，因此其正在發(fā)展成為一項(xiàng)一線(xiàn)神經(jīng)性感染疾病的診斷技術(shù)。但我認(rèn)為它不會(huì)替代傳統(tǒng)的診斷技術(shù)，對(duì)于黃病毒腦炎等，血清學(xué)的檢測(cè)，包括IgM抗體檢測(cè)仍然主要的確診實(shí)驗(yàn)。第二代測(cè)序?qū)NA病毒的檢測(cè)，其靈敏度目前還達(dá)不到臨床期待的水平。在未來(lái)，如果第二代測(cè)序成本進(jìn)一步降低，可及性進(jìn)一步提高，其可能成為一項(xiàng)一線(xiàn)檢測(cè)手段，更多的腦炎病例會(huì)在首次腰穿腦脊液檢查時(shí)采用第二代測(cè)序。有必要探索以第二代測(cè)序?yàn)楹诵牡纳窠?jīng)感染病原體診斷策略，第二代測(cè)序與傳統(tǒng)檢測(cè)手段聯(lián)合應(yīng)用，傳統(tǒng)檢測(cè)方法（如血清學(xué)檢測(cè)、PCR、培養(yǎng)法等）可作為第二代測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)或補(bǔ)充試驗(yàn)。

關(guān)鴻志教授：

對(duì)于疾病而言，精準(zhǔn)的診斷是有效治療的基礎(chǔ)。如果以神經(jīng)性感染疾病為例，神經(jīng)性感染疾病患者種類(lèi)非常多，病情多較危急，現(xiàn)實(shí)情況下不允許進(jìn)行多次經(jīng)驗(yàn)性治療，我們醫(yī)院目前在進(jìn)行的腦炎一體化診斷項(xiàng)目，項(xiàng)目入組標(biāo)準(zhǔn)為腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)>5×106L，即根據(jù)國(guó)際衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，存在腦炎的癥狀，且腦脊液白細(xì)胞升高可確認(rèn)為腦炎綜合征。腦炎的病因總體上分為有感染性和自身免疫性?xún)纱箢?lèi)，因此確診腦炎的患者會(huì)進(jìn)行第二代測(cè)序和自身免疫性腦炎相關(guān)抗體檢測(cè)。如果二者結(jié)果均呈陰性，會(huì)追加腫瘤相關(guān)檢測(cè)，綜合應(yīng)用以上技術(shù)可達(dá)到60%~70%的確診率，這樣可在首次腰穿后達(dá)到一個(gè)較高的確診率。若在三、五年前是無(wú)法實(shí)現(xiàn)這樣高的確診率。我們也希望通過(guò)提高確診率，來(lái)提高治療的及時(shí)性和效果，從而改善患者預(yù)后。

許建成教授：

第1點(diǎn)，最重要的一點(diǎn)，無(wú)論是臨床還是檢驗(yàn)科都希望做一項(xiàng)工作，就是根據(jù)不同部位或不同類(lèi)型標(biāo)本，繪制出致病菌譜。目前在解讀報(bào)告時(shí)，最常見(jiàn)的問(wèn)題是需要評(píng)估檢測(cè)到的病原體是致病菌還是定植菌。因此未來(lái)可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分析各種標(biāo)本的致病菌及定植菌。

第2點(diǎn)，感染性疾病不同部位、不同類(lèi)型標(biāo)本mNGS檢測(cè)的相關(guān)性值得探討。對(duì)于同一種感染，我們可以采集不同部位標(biāo)本，如肺炎患者除了采集痰液，也可以采集血液標(biāo)本或其他類(lèi)型標(biāo)本，因此分析不同部位標(biāo)本mNGS檢測(cè)的價(jià)值及相關(guān)性是未來(lái)臨床研究工作之一。

第3點(diǎn)，雖然目前mNGS檢測(cè)主要關(guān)注的是病原體的檢測(cè)，對(duì)致病菌的耐藥分析還較少關(guān)注，但未來(lái)我們可以將mNGS與傳統(tǒng)檢測(cè)方法（紙片法、MIC法、PCR法等）比較，探究不同方法之間的相關(guān)性。

許建成教授：

mNGS檢測(cè)面臨挑戰(zhàn)，包括費(fèi)用偏高、報(bào)告時(shí)間偏長(zhǎng)、測(cè)序深度偏低、目前檢測(cè)流程尚未標(biāo)準(zhǔn)化(閾值、背景菌等)、質(zhì)量保證體系尚不完善、報(bào)告尚不規(guī)范、報(bào)告解讀常與臨床脫節(jié)、與傳統(tǒng)方法的結(jié)合有待加強(qiáng)等。mNGS技術(shù)是一個(gè)非常有前景的技術(shù)，但在臨床研究和科研方面，仍需繼續(xù)研究和評(píng)估，使其能為臨床提供更有價(jià)值的服務(wù)。

卓超教授：

目前，在中國(guó)，mNGS正處于高速發(fā)展的階段，也幫助臨床解決了很多問(wèn)題。未來(lái)可以?xún)?yōu)化的有以下幾個(gè)方面：

第1點(diǎn)，是DNA/RNA雙流程檢測(cè)的問(wèn)題，在mNGS檢測(cè)中，若臨床醫(yī)生默認(rèn)送檢程序?yàn)镈NA流程，則可能存在部分重要的RNA病毒（如流感病毒、新型布尼亞病毒等）漏檢的情況。

第2點(diǎn)，是前處理優(yōu)化問(wèn)題，mNGS檢測(cè)關(guān)鍵的兩個(gè)點(diǎn)是核酸富集及去除人源宿主核酸。目前大部分公司采用的是反向富集的方式，采用正向富集的較少，未來(lái)可通過(guò)正向富集和反向富集結(jié)合的方式來(lái)優(yōu)化。此外，可通過(guò)定量PCR法檢測(cè)人源宿主核酸占比的方式在前處理階段進(jìn)行優(yōu)化。

第3點(diǎn)，是數(shù)據(jù)庫(kù)優(yōu)化問(wèn)題，目前很多測(cè)序公司直接下載現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)，但應(yīng)用于臨床時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，因此在未來(lái)可通過(guò)臨床建立數(shù)據(jù)庫(kù)，為病原體的檢出和疾病診斷提供更精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)。

第4點(diǎn)，是被靶向加靶向的問(wèn)題，目前mNGS檢測(cè)價(jià)格昂貴，新開(kāi)發(fā)的靶向二代測(cè)序(tNGS)，可靶向檢測(cè)常見(jiàn)的引起感染性疾病的病原體，因此降低了檢測(cè)費(fèi)用，同時(shí)還有助于重要的毒力基因和耐藥基因的檢出，從而指導(dǎo)臨床用藥。

第5點(diǎn)，也是最難的一點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)人工智能的解讀，大家公認(rèn)檢測(cè)結(jié)果的解讀需結(jié)合臨床，但是臨床醫(yī)生的認(rèn)知水平參差不齊，因此，建立人工智能分析，可為基層醫(yī)生或者更多受眾面進(jìn)行準(zhǔn)確地分析提供幫助。

第6點(diǎn)，是測(cè)序公司本土化，本土化對(duì)于送檢流程及標(biāo)本質(zhì)量控制非常重要，目前大部分標(biāo)本是由臨床醫(yī)生采集后，由第三方公司派人送檢，整個(gè)過(guò)程均可能造成標(biāo)本污染，而降低最終報(bào)告的可信度和價(jià)值。因此在未來(lái)，希望mNGS檢測(cè)實(shí)現(xiàn)本土化，同時(shí)與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行比對(duì)，最終得到一個(gè)準(zhǔn)確、可信的報(bào)告。

李維教授：

第1點(diǎn)，是目前收費(fèi)和檢測(cè)成本太高，而國(guó)內(nèi)不少醫(yī)院檢驗(yàn)科都躍躍欲試，希望通過(guò)自建平臺(tái)或分子實(shí)驗(yàn)室自己做mNGS，首先需要把價(jià)格和成本降下來(lái)，把實(shí)惠留給患者；另外還必須有足夠的標(biāo)本量才能支撐昂貴的儀器和芯片費(fèi)用，能否開(kāi)得起機(jī)，這可能是目前醫(yī)院檢驗(yàn)科想要自建平臺(tái)和已經(jīng)開(kāi)始做mNGS面臨的最大“瓶頸”和最現(xiàn)實(shí)的問(wèn)題。

第2點(diǎn)，是mNGS報(bào)告時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，離臨床需要的時(shí)間有一定的差距。前面專(zhuān)家談到實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)的本地化，都一致認(rèn)為本地化檢測(cè)是醫(yī)院招標(biāo)或找第三方平臺(tái)的重要衡量標(biāo)準(zhǔn)之一。本地化檢測(cè)可明顯縮短報(bào)告時(shí)間，且可減少因運(yùn)輸產(chǎn)生的標(biāo)本交叉污染的問(wèn)題。

第3點(diǎn)，是測(cè)序深度不夠高的問(wèn)題，各家平臺(tái)和公司的測(cè)序深度參差不齊，但沒(méi)有相關(guān)法規(guī)做出明確的規(guī)范。當(dāng)然測(cè)序深度的把控需要與檢測(cè)成本結(jié)合起來(lái)，從中找到既能滿(mǎn)足檢測(cè)需求，又能控制檢測(cè)成本的平衡點(diǎn)。

第4點(diǎn)，是標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題，2022年國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心公布的mNGS室間質(zhì)評(píng)結(jié)果依然不理想，所以各實(shí)驗(yàn)室和第三方平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)操作還需進(jìn)一步規(guī)范，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇需要進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)化，各方面均有待提高。

最后一點(diǎn)，檢驗(yàn)人可在未來(lái)將更多的精力投入到耐藥基因的相關(guān)研究上，這可能是下一個(gè)值得關(guān)注的“風(fēng)口”。

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李維

重慶大學(xué)附屬中心醫(yī)院/

重慶市急救醫(yī)療中心

檢驗(yàn)科

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許建成

吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科

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陳茶

廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院檢驗(yàn)科

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卓超

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一

醫(yī)院/廣州呼吸健康研究院感染科

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余方友

上海市肺科醫(yī)院/

同濟(jì)大學(xué)附屬肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科

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關(guān)鴻志

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科

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知網(wǎng)首發(fā)：李維,卓超,許建成,等.mNGS在檢驗(yàn)與臨床中的應(yīng)用[J/OL].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，[2022-12-27].

http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20221222.1020.002.html