【專家論壇】病原宏基因組高通量測序性能確認方案

菌心說 2022-09-25 發(fā)布于北京

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文章來源：中華檢驗醫(yī)學雜志, 2022,45(9) : 899-905

作者：張棟張京家杜娟尚雪松陳雨吳潔伊潔楊卓徐英春楊啟文

摘要

宏基因組學利用新一代高通量測序技術(shù)，以特定環(huán)境下病原體基因組為研究對象，在分析病原體多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系的基礎上，進一步探究病原體的群體功能活性、相互作用及其與環(huán)境之間的關(guān)系，發(fā)掘潛在的生物學意義。目前，絕大部分的宏基因組學研究都集中在臨床價值評價，宏基因組檢測臨床應用前分析性能確認的研究相對空白，北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科研究團隊結(jié)合多年病原宏基因組檢測的經(jīng)驗和國內(nèi)外相關(guān)研究成果，就病原宏基因組項目醫(yī)院本地化開展前的性能確認工作，從臨床預期用途、方法學建立、性能確認、標準操作作業(yè)書4個方面提出了具體的實施方案，具體包含：標本類型和病原體范圍、生物信息流程建立、生物信息分析參考盤制備和評估、濕實驗流程的建立、背景核酸數(shù)據(jù)模型的建立、參考盤制備和全流程的性能確認等。

病原宏基因組測序（metagenome next- generation sequencing，mNGS），基于宏基因組學和高通量測序技術(shù)，可對各種臨床標本中所有的病原體（包含細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體/衣原體等）進行無差別檢測^［^1, 2］。mNGS適用于各種病原體的鑒定，特別是未知新發(fā)病原體，如新型冠狀病毒等^［^3, 4］，故在新發(fā)突發(fā)、復雜及混合感染的病原體實驗室診斷中，有望提供重要的病原學診斷依據(jù)。由于mNGS仍然是一項較為前沿的技術(shù)，絕大部分相關(guān)研究多聚焦于其臨床應用價值評價，分析性能確認領域相對空白^［^5, 6, 7］。鑒于mNGS測序的濕實驗和干實驗過程涉及的試劑、數(shù)據(jù)庫、軟件等暫無標準化要求，不同實驗室病原宏基因組檢測流程采取的方案存在一定差異^［^{8, 9, 10］}。因此，在實驗室開展臨床檢測前，建議遵照美國臨床實驗室改進法案修正案（Clinical Laboratory Improvement Amendments，CLIA）和美國病理學家協(xié)會（College of American Pathologists，CAP）實驗室管理相關(guān)指導文件，同時參考國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）、中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）和美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）等機構(gòu)對體外診斷試劑認證原則，進行mNGS的性能確認^［^11］。本文立足于北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科mNGS的建設經(jīng)驗和國內(nèi)外相關(guān)研究，提出臨床開展前的單中心性能確認方案（圖1）。

圖1 協(xié)和方案流程圖

一、檢測標本類型和病原體范圍
mNGS檢測涉及標本類型、檢測流程和病原體眾多。因此醫(yī)院在mNGS方法學建立和性能確認時，建議根據(jù)臨床預期用途，確定標本類型和病原體范圍^［^1，5］。
呼吸道感染是重要的感染性疾病之一，中國每年有約400萬人次重癥肺炎患者。國內(nèi)的一項重癥醫(yī)學研究結(jié)果表明，超過60%的膿毒癥患者由肺炎誘發(fā)^［^8］。而細菌、真菌、病毒引起的肺炎多以侵染終末細支氣管、肺泡等結(jié)構(gòu)為主，因此肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的病原學檢測結(jié)果準確性更高^［^12, 13］。除此之外，BALF中定植菌和宿主細胞組成相對復雜，病原類別涵蓋細菌、真菌、病毒、寄生蟲和非典型病原體等。所以BALF標本可作為全面評估m(xù)NGS的代表性標本類型。
mNGS具有對不同病原體進行無偏倚檢測的潛力，但評估數(shù)萬種微生物的實驗計劃存在較大難度，有針對性地對臨床重點關(guān)注的病原體進行有效性評估可行性更高。同時，建議參考傳統(tǒng)的商品化分子生物學檢測試劑的性能指標，以建立相對合理的mNGS分析性能。例如：細菌的最低檢測限不高于3 000~4 000 菌落形成單位（colony forming units，CFU）/ml，病毒的最低檢測限不高于1 000拷貝數(shù)/ml^［^14, 15］。
協(xié)和方案：（1）優(yōu)先選擇BALF標本作為mNGS性能確認的樣本類型；（2）參考約翰霍普金斯大學ABX指南（https：//www.hopkinsguides.com/hopkins/index/Johns_ Hopkins_ABX_Guide/Pathogens）、臨床微生物學手冊（第十二版）和哈里森感染病學（第七版），篩選導致肺炎的80種常見病原體；（3）細菌和病毒最低檢測限建議達到1 000拷貝/ml或更低水平。

二、mNGS生物信息分析流程建立
病原宏基因分析主要涵蓋以下4個模塊：（1）低質(zhì)量序列過濾（接頭序列，測序質(zhì)量低的序列，含有N的序列，低復雜度序列）；（2）宿主序列過濾；（3）物種注釋；（4）陽性檢出判定^［^7］。mNGS生信分析流程的搭建需要計算機和生物信息學專業(yè)知識。缺少專業(yè)生物信息分析員工的實驗室，建議使用開源的分析流程，如SUPRI+或經(jīng)過大量臨床標本驗證的成熟商業(yè)分析軟件^［^7，12］，并進行性能確認。同時，在建立生物信息流程時，建議建立病原基因組的從頭組裝和進化分析流程^［^16］。
協(xié)和方案：（1）選擇SE50（MGI）或SE75（Illumina）；（2）選用fastp處理接頭序列和低質(zhì)量序列^［^17］；（3）使用自建的分析腳本去除含N的序列；（4）選用人類參考基因組hg38、hg19和人線粒體參考基因組作為宿主參考基因組^［^18］，比對軟件選用BWA并構(gòu)建兼容的比對數(shù)據(jù)庫^［^19］；（5）選用開源的SUPRI+流程進行物種注釋^［^7］；（6）選用metaSPAdes和megaHIT進行從頭組裝^［^20, 21］，選用重疊群組裝箱（contig integrator for sequence assembly，CISA）整合組裝結(jié)果^［^22］；（7）使用MuMer計算平均核苷酸相似度（average nucleotide identity，ANI）^［^23］；（8）使用熱圖方式展示ANI結(jié)果，根據(jù)ANI結(jié)果發(fā)掘潛在的新發(fā)病原體^［^24］（圖2）。
圖2 協(xié)和病原宏基因組生信分析流程圖

三、生物信息分析流程性能確認參考盤制備
隨著宏基因組測序技術(shù)廣泛應用于臨床，科學研究者和臨床專家均意識到生物信息分析的可靠性是保證結(jié)果準確的決定因素之一，加強流行病學中觀察性研究報告質(zhì)量（STrengthening the Reporting of OBservational studies in Epidemiology，STROBE）和CAP等學術(shù)組織都提出了對宏基因組生物信息分析流程驗證的建議^［^5，25］。內(nèi)容主要包括：（1）驗證近緣物種的相互交叉干擾率評估^［^26］；（2）分析流程的靈敏度評估；（3）數(shù)據(jù)庫的完整性和代表性評估^［^27］。
協(xié)和方案：（1）根據(jù)制定的物種清單（80種），收集同屬內(nèi)所有微生物的代表基因組；（2）根據(jù)病原體種類不同，分別從病理系統(tǒng)資源整合中心（PAThosystems Resource Integration Center，PATRIC，https：//www.patricbrc.org/）和臨床級微生物數(shù)據(jù)庫（Food and Drug Administration-database for Regulatory-Grade microbial Sequences，F(xiàn)DA- ARGOS，https：//www.fda.gov/medicaldevices/science- and-research-medical-devices/databasereference-grade-microbial-sequen ces-fda-argos）中篩選細菌參考基因組^［^28, 29］，從全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織數(shù)據(jù)庫（Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID，https：//www.gisaid.org/）、病毒參考數(shù)據(jù)庫（Reference Viral DataBase，RVDB，https：//rvdb.dbi.udel.edu/）和美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）^［^30］中篩選病毒參考基因組，從真菌和卵菌信息網(wǎng)（Fungal and Oomycete Informatics Resources，F(xiàn)ungiDB，https：//fungidb.org/fungidb/app）和NCBI中篩選真菌參考基因組^［^32, 33］，從蠕蟲寄生蟲信息網(wǎng)（WormBase ParaSite，https：//parasite.wormbase.org/index.html）和NCBI中篩選寄生蟲參考基因組^［^32，34］；（3）微生物參考基因組篩選原則如下：①優(yōu)先選擇宿主為人類的基因組序列；②優(yōu)先選擇基因組更完整的數(shù)據(jù)，部分微生物無完整基因組時，優(yōu)先選擇部分組裝的基因組序列；③優(yōu)先選擇中國地區(qū)上傳的基因組序列；（4）使用全基因組模擬器（whole genome simulation，wgsim）制備評估用模擬數(shù)據(jù)^［^35］；（5）設置數(shù)據(jù)庫中的所有物種不同序列數(shù)梯度的模擬數(shù)據(jù)；（6）根據(jù)物種進化速率，模擬生成新發(fā)病原體的測序數(shù)據(jù)^［^36］。

四、生物信息分析流程性能確認指標
本方案中，在參考計算機軟件評估要求的基礎上擬定mNGS生物信息分析流程性能確認的評估指標，主要包括準確率、召回率、精確率、F1-Score和最低測序數(shù)據(jù)量^［^37］。
（一）準確率、召回率、精確率和F1-Score
1.生物信息分析陽性檢出閾值的標準：（1）檢出種特異性序列數(shù)至少1條；（2）與同屬內(nèi)檢出序列數(shù)第一位物種間比值大于10%^［^7］。
2. 肺泡微生態(tài)模擬數(shù)據(jù)的生成：對1 000份既往已進行mNGS檢測的BALF標本進行重分析，統(tǒng)計標本中微生態(tài)的組成和豐度情況，使用宏基因組仿真數(shù)據(jù)生成軟件（Critical Assessment of Metagenome Interpretation，CAMISIM）模擬微生態(tài)數(shù)據(jù)^［^35］。
3. 模擬陽性標本測序數(shù)據(jù)的生成：隨機生成10、100、1 000、10 000和100 000條病原體序列，并分別與微生態(tài)模擬數(shù)據(jù)整合。使用自建分析流程和數(shù)據(jù)庫對每份模擬數(shù)據(jù)重復分析100次，分別計算：準確率=（TP+TN）/（TP+FN+FP+TN）；召回率=TP/（TP+FN）；精確率=TP/（TP+FP）；F1-Score=2×準確率×召回率/（準確率+召回率）；TP，真陽性；FP，假陽性；TN，真陰性；FN，假陰性。
（二）最低測序數(shù)據(jù)量
對上述1 000份BALF的背景微生物進行基因組大小的加權(quán)平均計算，獲得背景微生物的平均基因組長度。根據(jù)人源序列和背景微生物的比例分布范圍，估算背景微生物平均拷貝數(shù)。
已有數(shù)據(jù)表明，BALF宿主細胞中位值在10⁵ 細胞數(shù)/ml，極限高值為10⁷ 細胞數(shù)/ml^［^38］。本方案中，擬定病原體最低拷貝數(shù)10³ 拷貝/ml，并考慮背景菌平均基因組和拷貝數(shù)。
根據(jù)Dirk H?per團隊提供的數(shù)學模型（伯努利隨機過程）推導出所需最低測序數(shù)據(jù)量^［^39］。

五、mNGS實驗流程建立
mNGS濕實驗環(huán)節(jié)的方法學建立主要涉及核酸提取、建庫等流程，在檢測體系建立時，需進行充分評估。第一，不同的提取試劑對細菌、真菌、病毒的核酸提取效率存在差異^［^{40, 41, 42］}。同時，提取流程中是否有破壁過程以及破壁的條件也會影響核酸提取效率^［^12］。第二，根據(jù)已發(fā)表的專家共識，當臨床標本中宿主細胞濃度高時，為提高低載量病原體的檢出率，建議添加去宿主過程^［^42］。第三，mNGS應用于科學研究時多采用單份標本最低20M的測序數(shù)據(jù)量，但臨床應用時需要多少測序數(shù)據(jù)量存在較大的爭議。建議在建立方法學時，進行最低測序數(shù)據(jù)量的評估。第四，背景微生物的核酸片段是干擾mNGS結(jié)果的重要因素。建議在建立方法學時，根據(jù)實際情況建立背景核酸數(shù)據(jù)模型^［^{1，5，16］}，協(xié)和方案如下。
（一）核酸提取效率評估
使用固定CFU的代表性菌株，使用Qiagen的提取試劑盒提取核酸，并使用微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）進行定量，每一菌株重復3次以計算均值；以陰性BALF剩余標本為基質(zhì)，加入固定CFU的代表性菌株制備模擬標本，以實驗室擬使用的提取流程進行核酸提取，使用ddPCR進行定量，并重復3次以計算均值；計算兩者間比值，定義為提取流程對代表性菌株的提取效率。
（二）去宿主病原體損耗評估
去宿主病原體損耗評估參考盤制備：擬投入的病原體為鮑曼不動桿菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、白色念珠菌、煙曲霉、表皮葡萄球菌、巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）和腺病毒，每種病原體濃度擬設定為1 000 拷貝/ml，每份標本中宿主細胞濃度擬控制在10⁵ 細胞數(shù)/ml。
隨機選擇6份模擬標本平均分為2組，一組使用去宿主試劑進行處理，另一組不進行去宿主處理，獲得核酸后同時進行建庫測序和ddPCR。
統(tǒng)計分析2組不同處理標本目標病原體每百萬序列數(shù)（reads per million，RPM）和定量結(jié)果的差異。
統(tǒng)計分析2組標本宿主基因組比率和內(nèi)參基因定量結(jié)果的差異。
（三）最低測序數(shù)據(jù)量評估
1.DNA流程最低測序數(shù)據(jù)量參考盤制備：擬投入病原體同“五（二）”中使用的病原體。分別使用宿主細胞濃度為10⁵ 細胞數(shù)/ml和10⁷ 細胞數(shù)/ml的肺泡灌洗液剩余標本作為稀釋基質(zhì)^［^38］，建議每種病原體濃度1 000 拷貝/ml，不同宿主濃度梯度的標本建議重復檢測不少于5次^［^5］。
2.RNA流程最低測序數(shù)據(jù)量參考盤制備：擬投入病原體甲型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和冠狀病毒，每種病原體濃度為1 000 拷貝/ml（參考ddPCR結(jié)果）。宿主細胞濃度同DNA流程最低測序數(shù)據(jù)量參考盤。不同宿主濃度梯度的模擬標本建議重復檢測不少于5次^［^5］。
3.最低測序數(shù)據(jù)量評估：每份標本的測序數(shù)據(jù)量為400 兆（megabyte，M）reads，隨機抽取12.5、25、50和100 M各20次分別進行生信分析流程進行分析，通過probit回歸分析合理的最低測序數(shù)據(jù)量。
（四）建立試劑及環(huán)境背景核酸數(shù)據(jù)庫
1.試劑工程菌背景核酸的建立：（1）酒精清潔雙手，建議準備好2 ml EP管12個，在試劑準備間超凈工作臺內(nèi)，每個EP管中分裝1 ml生理鹽水并編號；（2）將標本隨機平分為2組，分別使用去宿主流程和不去宿主流程進行測序；（3）測序后，分析去宿主流程和不去宿主流程的微生物檢出情況和相對豐度。
2.實驗室空間和設備表面背景核酸的建立：（1）酒精清潔雙手，按照實驗室實際情況準備2 ml EP管若干，在核酸提取區(qū)生物安全柜中分裝1 ml 生理鹽水至每個EP管中并編號。（2）使用無菌拭子分別對每個實驗區(qū)的臺面和設備（實驗臺面、生物安全柜、離心機孔位及表面、均質(zhì)儀孔位及表面、PCR擴增儀孔位及表面、渦旋震蕩儀表面、恒溫金屬浴孔位及表面、測序儀表面、操作人員手部、口罩外層等）進行擦拭采集環(huán)境標本，將拭子裝入EP管中進行振蕩混勻。建議同一位置連續(xù)3 d進行標本采集。為便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，建議每批次實驗設置1份未采集環(huán)境標本的拭子作為空白對照。（3）測序后，分析各位置的微生物組成和相對豐度，建立實驗室操作空間和設備背景核酸數(shù)據(jù)模型。
（五）質(zhì)量控制點和風險控制點設置
建議測定提取核酸的濃度和純度，DNA/RNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值不低于1.8/2.0。文庫構(gòu)建完成時再次測定核酸濃度和純度，當文庫濃度低于0.1 ng/μl時，建議重新實驗。同時，建議測序數(shù)據(jù)量和測序質(zhì)量值作為質(zhì)量控制點之一，當測序數(shù)據(jù)量低于最低測序量或Q30低于80%時，建議重復檢測。同時，本方案建議在標本中加入經(jīng)過ddPCR定量摩爾濃度的大腸桿菌噬菌體（DNA流程使用T7噬菌體，RNA流程使用M2噬菌體）作為內(nèi)標；建議每輪實驗同時檢測3倍最低檢出限（limit of detection，LoD）濃度的弱陽性質(zhì)控、10倍LoD濃度的陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

六、mNGS全流程性能確認參考盤制備
目前，對于病原mNGS性能確認參考盤的制備缺少統(tǒng)一和規(guī)范的標準。國外針對呼吸道標本和腦脊液標本的參考盤制備方法是在陰性的臨床標本中加入梯度稀釋的臨床陽性標本、病原體培養(yǎng)物或病原體核酸^［^5，11］。該方法保證了參考盤接近臨床標本的理化性質(zhì)和微生態(tài)特征，但無法固定宿主細胞率，且臨床標本異質(zhì)性高，標本間微生態(tài)存在差異。不同的參考盤配置方法各有利弊^［^5，11］，本方案中建議使用宿主細胞混合病原體或臨床陽性標本的策略。
（一）DNA流程性能確認參考盤制備
使用mNGS檢測為陰性的肺泡灌洗液剩余標本和生理鹽水作為稀釋基質(zhì)，建議宿主細胞濃度設定為10⁵ 細胞數(shù)/ml；分別投入“五（二）”中使用的病原體，建議病原體濃度梯度設定為0（空白）、160、800、4 000、20 000和100 000拷貝/ml。
（二）RNA流程性能確認參考盤制備
使用mNGS檢測為陰性的肺泡灌洗液剩余標本和生理鹽水作為稀釋基質(zhì)，按照“六（一）”濃度梯度，分別投入“五（三）2”中使用的病原體。

七、mNGS全流程性能確認
對于mNGS檢測，標本采集和轉(zhuǎn)運過程、宿主細胞濃度等可影響背景核酸、陽性判斷閾值和LoD等性能。建議針對一般情況，初步建立檢測體系的陽性判斷閾值、LoD、精密度、抗干擾、交叉反應情況，并對標本的穩(wěn)定性和臨床實際應用時檢測體系的準確性進行初步探討。
（一）BALF相關(guān)背景核酸、陽性判斷閾值和LoD
使用實驗室建立的實驗流程對制備的參考盤進行檢測，分別統(tǒng)計不同病原體的RPM，結(jié)合試劑及環(huán)境背景核酸模型，分別繪制相應的受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）以確立相對合理的陽性判斷閾值。
使用probit回歸計算不同病原體的LoD^［^7］。
對于暫時無法或難以獲取的其他病原體，建議通過統(tǒng)計陰性BALF標本、試劑及環(huán)境背景核酸中各病原體的RPM，以均值加3倍標準差作為陽性判斷閾值^［^43］。
（二）精密度確認
1.使用同批次試劑：對弱陽性標本（3倍LoD濃度）和陽性標本（10倍LoD濃度）分別進行20次重復檢測并統(tǒng)計RPM，建議每天重復5次檢測，連續(xù)4 d完成評估。
2.使用不同批次試劑：對弱陽性標本和陽性標本分別進行20次重復檢測并統(tǒng)計RPM，建議每天重復5次檢測，連續(xù)4 d完成評估。
（三）抗干擾確認
調(diào)整弱陽性標本的宿主細胞濃度至10⁵、10⁶、10⁷細胞數(shù)/ml 3個濃度梯度，分別進行測序。以弱陽性質(zhì)控無法檢出時內(nèi)參的RPM值為抗宿主干擾閾值。當進行臨床報告解讀時，若內(nèi)參的RPM超出閾值，需警惕假陰性。
（四）交叉干擾確認
選取若干種近源物種，例如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌、白色念珠菌和熱帶念珠菌，將兩對微生物分別按照1∶1、9∶1、1∶9的濃度比例進行混合后測序；統(tǒng)計分析近源物種的檢出情況和比例與預期是否一致。
（五）穩(wěn)定性確認
將弱陽性標本和陽性標本在4 ℃和?20 ℃分別保存1、4、7 d之后進行檢測，統(tǒng)計RPM；一般認為標本在?80 ℃可在較長時間內(nèi)穩(wěn)定保存。本方案建議評估?80 ℃保存的標本反復凍融時對結(jié)果的影響。分別評估在?80 ℃保存的標本凍融1和2次后檢測結(jié)果的RPM變化情況。
（六）臨床準確性評估
建議收集既往mNGS檢測結(jié)果為陰性的BALF剩余標本50份，陽性剩余標本20份，分別進行DNA流程和RNA流程檢測。對于陽性標本，建議與既往培養(yǎng)結(jié)果或使用PCR復核^［^26］，統(tǒng)計總符合率、陽性符合率和陰性符合率。

八、mNGS全流程標準操作作業(yè)書（standard operating procedure，SOP）建立
完成性能確認后，建議根據(jù)建立的實驗流程，編寫可讀性強的SOP。建議分別制定DNA流程和RNA流程的SOP，涵蓋實驗操作具體步驟及注意事項、質(zhì)量控制點及操作處理指示、實驗記錄的規(guī)范和注意事項、數(shù)據(jù)分析及解讀流程、數(shù)據(jù)備份及安全管理指示和管理員權(quán)限等重要的具體細節(jié)，保證全流程的操作規(guī)范、可重復和可溯源^［^11］。
近年來，mNGS技術(shù)對臨床感染性疾病的診斷，尤其是在新發(fā)突發(fā)病原體比如新型冠狀病毒的鑒定中發(fā)揮了重要作用。但目前病原mNGS的性能確認、質(zhì)量控制和規(guī)范化的管理，學術(shù)界仍然有較大空白。為保證臨床檢測結(jié)果的可靠性，本方案中提出的性能確認流程相對復雜。盡管性能確認不能解決mNGS技術(shù)中存在的諸多問題，但能夠為mNGS的工作人員提供諸如核酸提取效率、去宿主效率、數(shù)據(jù)庫、生物信息學分析流程、背景核酸和陽性判斷閾值等相關(guān)參數(shù)信息，同時能夠明確全流程的精密度、LoD、抗干擾、交叉反應和穩(wěn)定性等相關(guān)性能，這些信息對于mNGS報告解讀具有重要的指導價值。本方案中仍存在不足和錯誤之處，希望同行批評指正，繼續(xù)完善性能確認方案，為mNGS的臨床規(guī)范化應用貢獻更多的智慧和力量。

參考文獻（略）