大家好，今天給大家?guī)淼囊黄墨I(xiàn)是Molecular Characterization of Astrocytoma Progression Towards Secondary Glioblastomas Utilizing Patient-Matched Tumor Pairs，2020年發(fā)表于Cancers，目前影響因子6.126分，根據(jù)文章的題目與摘要，我們可以發(fā)現(xiàn)本文的主要研究疾病是原發(fā)與繼發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，目的是研究兩種疾病中分子特征的改變，包括基因拷貝數(shù)，基因表達(dá)譜以及基因突變頻率改變等信息。

研究背景與研究目的

星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤主要可分為彌漫性或間變性星形細(xì)胞瘤的人腦部腫瘤，并且具有發(fā)展為繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的傾向。因而，本文主要是為了探尋初發(fā)與復(fù)發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的多種分子特征，來了解腫瘤的進(jìn)展。

主要研究內(nèi)容

基因拷貝數(shù)譜的改變，可以發(fā)現(xiàn)彌漫性星形細(xì)胞瘤未見10號染色體缺失，而相應(yīng)的復(fù)發(fā)性腫瘤有10號染色體缺失。

基因表達(dá)譜改變，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的腫瘤顯示出強(qiáng)烈的向間充質(zhì)亞型轉(zhuǎn)變的趨勢，星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤可通過影響細(xì)胞分裂、相互作用和分化的信號通路表達(dá)信號促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

基因突變頻率改變，作者通過研究不同的原癌基因的突變情況，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者IDH1的突變頻率最高，其次是TP53，且值得關(guān)注的是，MUC4也會發(fā)生突變。

研究思路與結(jié)果概述

▲ Fig1 作者用示意圖來簡要介紹了本文的分析流程，也就是先選擇22對原發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞

瘤與繼發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者，接著使用多組學(xué)分析的發(fā)發(fā)，來探究兩種疾病中不同的分子特征。

數(shù)據(jù)解讀

這里我們再來詳細(xì)了解一下作者所做的原發(fā)與繼發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的配對如下：

A2→A3:彌漫性星形細(xì)胞瘤向間變性星形細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)變；

A2→G4：彌漫性星形細(xì)胞瘤向繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)變；

A3→G4：間變性星形細(xì)胞瘤到繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)變。

下面我要開始本文的主菜了，也就是數(shù)據(jù)論證的詳細(xì)解讀部分。

▲ Fig2 單個星形細(xì)胞瘤全基因組基因拷貝數(shù)改變

首先，作者做了aCGH,一種用于檢測染色體變異的技術(shù)，來探尋初發(fā)與復(fù)發(fā)性星形膠質(zhì)瘤患者中染色質(zhì)情況。作者首先秀了一張熱圖（fig 2A），提出根據(jù)基因拷貝數(shù)變異，將樣本分為3個大類，縱向表示1號染色體開始到性染色體為止基因的拷貝數(shù)變異情況，熱圖中藍(lán)色表示缺失，紅色表示重復(fù)，灰色表示基因拷貝數(shù)未發(fā)生改變,熱圖下方是不同的樣本及其腫瘤分型注釋。根據(jù)熱圖顯示，16對患者配對中只有7對（約44%）的初始腫瘤和相應(yīng)的復(fù)發(fā)腫瘤直接聚集在一起。16例患者配對中有5例的初發(fā)和復(fù)發(fā)腫瘤屬于兩個不同的主要亞群。

因此，對于50%以上的患者來說，初始腫瘤和相應(yīng)的復(fù)發(fā)腫瘤的染色體拷貝數(shù)特征是不同的。也就是，通過聚類分析，來說明本文研究的必要性。并且根據(jù)熱圖顯示，可以發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者匹配的復(fù)發(fā)腫瘤顯示出影響10號染色體的不同類型的缺失。另外在熱圖上，作者第二行顯示IDH1突變情況，第三行顯示腫瘤成分，第四行顯示在手術(shù)前是否接受過其他治療，可以顯示出根據(jù)其他情況并沒有明顯的聚類。Fig 2B-D中,作者進(jìn)一步說明這3類亞群中，23對染色體的拷貝數(shù)變異情況，其中中間這一類的染色體拷貝數(shù)變異最為明顯。

▲ Fig3.星形細(xì)胞瘤全基因組的基因表達(dá)譜

作者根據(jù)基因表達(dá)譜的相似性，對相應(yīng)的基因特異性表達(dá)值可視化（fig 3A）。其中藍(lán)色色調(diào)的值明顯小于零，灰色色調(diào)的值約為零，紅色色調(diào)的值明顯大于零。熱圖的第二行顯示IDH1突變情況信息，可觀察到典型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣基因拷貝數(shù)改變和表達(dá)譜的患者配對的P07和P12，P09，且P14-G4和P16-G4的也可緊密聚集。

接著，figB-C中將星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的主要簇的腫瘤與四個正常的大腦參考樣本進(jìn)行比較，并進(jìn)行上調(diào)與下調(diào)基因繪制韋恩圖，并找出其中特定癌癥相關(guān)基因注釋組的相應(yīng)數(shù)量的基因。

fig3D作者做了信號通路分析，觀察三個主要的基因表達(dá)簇中，受差異表達(dá)影響的特定信號通路的基因比例。

▲ Fig 4. 腫瘤表達(dá)譜數(shù)據(jù)與膠質(zhì)瘤-CpG島甲基化表型(G-CIMP)和Verhaak病理分型的關(guān)系

作者做了IDH1突變型星形膠質(zhì)瘤與野生型星形膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)差異性。發(fā)現(xiàn)334個基因下調(diào)，354個基因上調(diào)。

Fig 4A根據(jù)膠質(zhì)瘤-CpG島甲基化表型(G-CIMP)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤通常與CpG島甲基化表型有較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，但是在3例IDH1野生型膠質(zhì)瘤-CpG島甲基化呈負(fù)相關(guān)，而其他IDH1野生型腫瘤僅與G-CIMP亞型呈弱正相關(guān)。

fig4B-C,作者根據(jù)Verhaak分類將腫瘤分類為神經(jīng)型、類神經(jīng)型、經(jīng)典型或間葉型，發(fā)現(xiàn)初發(fā)為神經(jīng)型容易復(fù)發(fā)間葉型星形膠質(zhì)瘤，初發(fā)為經(jīng)典型的仍是經(jīng)典型或間葉型，初發(fā)為間葉型的則復(fù)發(fā)為其他病理類型均有可能。也就是說，原發(fā)星形膠質(zhì)瘤均有演變成間葉型星形膠質(zhì)瘤的可能。

▲ Fig 5.區(qū)分星形細(xì)胞瘤進(jìn)展組的差異表達(dá)基因和信號通路改變

Fig 5 作者使用three-state Hidden Markov Model (HMM)在三個進(jìn)展組(A2到A3，A2到G4，A3到G4)中尋找差異基因，發(fā)現(xiàn)A2至A3進(jìn)展組的6對患者匹配的腫瘤對中鑒定出2678個低表達(dá)基因和2087個高表達(dá)基因，在A2至G4進(jìn)展組的5對中鑒定出2048個低表達(dá)基因和2160個高表達(dá)基因，在相應(yīng)進(jìn)展組的至少一個患者匹配的腫瘤對中發(fā)現(xiàn)了4411個低表達(dá)基因和3642個高表達(dá)基因。使用韋恩圖尋找不同的差異基因，包括低表達(dá)基因取交集，高表達(dá)基因取交集，然后50%以上患者高表達(dá)或低表達(dá)的基因再次取交集，做信號通路的富集分析。由上圖韋恩圖結(jié)果可知，絕大多數(shù)改變的基因僅在特定的進(jìn)展組中觀察到，一些基因在兩個進(jìn)展組中以相同的方向改變，但這些頻繁改變的基因在所有三個進(jìn)展組中沒有一個是以相同的方向改變的（fig 5B-C）。

每對患者匹配的星形細(xì)胞瘤都確定了差異表達(dá)的信號和代謝途徑基因。

▲ Fig 6星形細(xì)胞瘤進(jìn)展組中頻繁改變基因的全基因組平均表達(dá)譜

Fig 6作者做了三個進(jìn)展組（A2到A3(Fig 6A)；A2到G4(Fig 6B)；A3到G4(Fig 6C)）中不同差異基因的變化倍數(shù)，并按照染色體位置的順序進(jìn)行排列。在圖中作者用紅色標(biāo)注高表達(dá)的基因，藍(lán)色標(biāo)注低表達(dá)的基因，標(biāo)記的一些基因是已知與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和代謝相關(guān)的基因。

▲ Fig 7 預(yù)測的體細(xì)胞單核苷酸變異(SNV)和頻繁突變的基因概述

研究發(fā)現(xiàn)，初發(fā)與復(fù)發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的體細(xì)胞單核苷酸變異發(fā)現(xiàn)單核苷酸變異(SNV)主要集中于復(fù)發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者（fig 7A），另外患者配對的膠質(zhì)瘤對的初次和復(fù)發(fā)腫瘤之間共享體細(xì)胞SNV的數(shù)量在8到186之間。

使用外顯子測序，可發(fā)現(xiàn)大多數(shù)影響外顯子的體細(xì)胞SNV是非同義替換，可觀察到內(nèi)含子與外顯子中單核苷酸變異的類型，特別是幾個復(fù)發(fā)腫瘤顯示停止突變的比例增加，且體細(xì)胞中內(nèi)含子也可發(fā)生單核苷酸變異（fig 7B）。

根據(jù)組織學(xué)分類的腫瘤中，突變最頻繁的基因是IDH1，緊隨其后的是TP53(fig 7C）。

接著根據(jù)配對腫瘤樣本中，基因突變頻率最高進(jìn)行排序和腫瘤進(jìn)展組進(jìn)行排序發(fā)現(xiàn)突變最頻繁的基因依然是IDH1，緊隨其后的是TP53（fig 7D-E）。

另外，LNP1是唯一在從A2進(jìn)展到A3的患者配對中發(fā)現(xiàn)的最頻繁的突變基因（fig 7E）。對于星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中最常發(fā)生突變的3個基因，根據(jù)Fig 7E可發(fā)現(xiàn)IDH1在從A2進(jìn)展到G4的配對患者中反復(fù)突變，超過60%的腫瘤對中發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的TP53突變，在超過30%的腫瘤對中發(fā)現(xiàn)MUC4和TTN的反復(fù)突變。

小結(jié)

那么我們來小結(jié)一下本文的內(nèi)容吧，從挑來看，作者按照初發(fā)與繼發(fā)性星型細(xì)胞膠質(zhì)瘤患者的基因拷貝數(shù)改變，并分析出不同染色體上缺失或重復(fù)片段的發(fā)生情況（fig 2）；

接著做了腫瘤組與正常組的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，并繪制了熱圖和韋恩圖（fig 3）；

然后做了進(jìn)展組的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，用了韋恩圖取交集來做差異基因，在差異基因進(jìn)一步根據(jù)發(fā)生的頻率細(xì)化，得到高頻率的差異基因（fig5 A-C），分析他們在染色質(zhì)上的位置以及表達(dá)水平(fig6)

從圈來看，本文對差異基因進(jìn)行通路分析（fig 5D-F），發(fā)現(xiàn)3類腫瘤進(jìn)展組中的差異基因主要在一些代謝相關(guān)信號通路中富集。

從靠來看，本文在熱圖中，作者會按照IDH1突變情況、腫瘤的類型（初發(fā)與復(fù)發(fā)）、腫瘤成分、患者的術(shù)前治療方式（比如化療、放療等）進(jìn)行聚類分析，然后探討這些因素和基因拷貝數(shù)、基因表達(dá)譜的關(guān)系；

另外，作者也有根據(jù)膠質(zhì)瘤甲基化水平和病例類型與腫瘤基因的相關(guān)性（fig 4）。

最后，作者還討論了這些基因突變在腫瘤中出現(xiàn)頻率，尤其是與腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤進(jìn)展組中的表達(dá)情況，來說明常見突變基因在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的臨床意義（fig）。