 CRISPR-Cas9 CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)由有DNA切割活性Cas9蛋白及識(shí)別特異靶點(diǎn)的gRNA組成，由于只需對(duì)系統(tǒng)中的gRNA進(jìn)行編輯就能實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)識(shí)別，極大了簡(jiǎn)化了構(gòu)建基因敲除載體的工作。 CRISPR-Cas9 賦予我們精準(zhǔn)編輯基因的能力 在 Google 學(xué)術(shù)上，CRISPR Cas9 相關(guān)的文獻(xiàn)已經(jīng)超過(guò) 51700 篇。 為何使用cas9的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，大多數(shù)基因組編輯都是通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)完成的，這對(duì)于常規(guī)的低通量應(yīng)用來(lái)說(shuō)是很有效的。 圖 1. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯原理圖  然而，對(duì)于其他的應(yīng)用，能夠穩(wěn)定表達(dá)其中一個(gè)組成部分，即CRISPR-Cas9核酸酶，會(huì)更加有效。   cas9 穩(wěn)定細(xì)胞系應(yīng)用 1)sgRNA功能驗(yàn)證; 2)使用慢病毒CRISPR進(jìn)行基因敲除; 3)sgRNA文庫(kù)篩選; 4)可誘導(dǎo)的基因組編輯。 應(yīng)用1:sgRNA功能驗(yàn)證 單個(gè)sgRNAs本身的效率存在差異。在進(jìn)行大量的篩選工作之前，需要確定哪些CRISPR sgRNAs能夠更加高效的進(jìn)行基因組編輯。  圖 2. 通過(guò)IndelCheck?體系對(duì) CRISPR sgRNAs功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)流程。 收集經(jīng) CRISPR 或 TALEN 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并針對(duì)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，使用靶點(diǎn) PCR 試劑盒（1）擴(kuò)增經(jīng)過(guò) CRISPR/TALEN 擴(kuò)增的靶點(diǎn)序列。所得的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)解鏈退火生成雜交 DNA 雙鏈產(chǎn)物，其中部分部分可能存在錯(cuò)配，可以被 T7 核酸內(nèi)切酶 I 試劑盒（2）酶切檢出。如果 CRISPR/TALEN 對(duì)基因組的編輯功能是陽(yáng)性的，錯(cuò)配酶切所產(chǎn)生的條帶可以通過(guò)電泳跑膠觀(guān)察到。 應(yīng)用2:使用慢病毒CRISPR進(jìn)行基因敲除 利用慢病毒介導(dǎo)CRISPR方法： （1）一個(gè)慢病毒表達(dá)Cas9和sgRNA （2）轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種不同的慢病毒，一種表達(dá)Cas9，另一種表達(dá)sgRNA。 由于Cas9 ORF的體積較大(>4.4 kb)，“all in one”或“Cas9-only”慢病毒的滴度明顯低于sgRNA-only慢病毒。 因此，GeneCopoeia建議，將表達(dá)cas9的穩(wěn)定細(xì)胞系與表達(dá)sgRNA的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高效的基因組編輯。 應(yīng)用3：sgRNA文庫(kù)篩選 CRISPR sgRNA文庫(kù)廣泛應(yīng)用于藥物靶向識(shí)別和驗(yàn)證、表型變化和報(bào)告分析。CRISPR會(huì)對(duì)遺傳密碼進(jìn)行永久性更改。因此，CRISPR可以完全敲除一個(gè)基因的所有等位基因，無(wú)論它們的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是定位于細(xì)胞核還是細(xì)胞質(zhì)。  圖 3. 使用 GeneHero? sgRNA 文庫(kù)進(jìn)行藥物靶標(biāo)研究的應(yīng)用示例。 上：96孔板培養(yǎng)能穩(wěn)定表達(dá)Cas9核酸酶的細(xì)胞系。中：使用 sgRNAs 文庫(kù)（獨(dú)立克隆文庫(kù)或混合文庫(kù)）對(duì)板上的 GeneHero? Cas9 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。下：對(duì)轉(zhuǎn)染后的96孔板進(jìn)行針對(duì)細(xì)胞死亡的篩選（圖為黑孔）。每個(gè)sgRNA都帶有barcode序列，因此相關(guān)的單個(gè)或多個(gè)sgRNA能被識(shí)別出來(lái)，列作藥物靶標(biāo)的候選。 應(yīng)用4:可誘導(dǎo)的基因組編輯 誘導(dǎo)型CRISPR (iCRISPR)最早由Gonzalez等人(2014)證明，他構(gòu)建了一個(gè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)模型細(xì)胞株，該細(xì)胞株攜帶Cas9，添加四環(huán)素誘導(dǎo)后才可以表達(dá)Cas9。文獻(xiàn)如下： Gonzalez, et al. (2014). An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 15, 215.Qiu, et al. (2004). Mutation detection using Surveyor? nuclease. Biotechniques 36, 702. 所以 這么有用的cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株 哪里來(lái)？   * 70+ 種人類(lèi)、小鼠、大鼠CRISPR-Cas9 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系； * 涵蓋26+ 種不同癌癥，如：肺癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌等細(xì)胞系。 * 通過(guò)safe harbor位點(diǎn)整合，確保 Cas9 穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)副作用。 * 可配合 sgRNA 克隆、sgRNA文庫(kù)以及供體克隆服務(wù) 使用。  高分文獻(xiàn)舉例 Combinatorial CRISPR-Cas9 Metabolic Screens Reveal Critical Redox Control Points Dependent on the KEAP1-NRF2 Regulatory Axis. 2018. Molecular Cell, IF 17.819. A549 and HeLa Cas9--expressing stable cell lines. Dissection and function of autoimmunityassociated TNFAIP3 (A20) gene enhancers in humanized mouse models. 2018. Nature Communications, IF 12.124. 293T Cas9-expressing stable cell line. |
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