在上一期《質(zhì)粒構(gòu)建：從入門到精通之初窺門徑》中我們介紹了構(gòu)建質(zhì)粒的方法，囿于篇幅原因，很多零碎知識(shí)并未做詳細(xì)介紹，所以在本文中我們將介紹以下內(nèi)容：1. TRIzol法抽提RNA；2. 逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA；3. 轉(zhuǎn)化；4. 質(zhì)粒的小量提取；5. 測(cè)序后序列的比對(duì)（DNAMAN的使用）。另外我們將在下期《質(zhì)粒構(gòu)建：從入門到精通之高手進(jìn)階》中介紹Kozak序列、標(biāo)簽的添加方法、如何判斷是否移碼等內(nèi)容，敬請(qǐng)期待！

0. TRIzol法抽提RNA；

1. 逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA；
2. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；
3. 質(zhì)粒小量提?。?br>4. 測(cè)序后結(jié)果的分析以及DNAMAN和Chromas的使用；

提取RNA比較成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比較穩(wěn)定且廣泛應(yīng)用的，當(dāng)然現(xiàn)在一些國(guó)產(chǎn)的TRIzol類產(chǎn)品也能滿足大部分情況下的RNA抽提。

注意事項(xiàng)及原理

注意事項(xiàng)：
1、RNA酶（RNase）非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后又會(huì)迅速?gòu)?fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸汽滅菌法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部。提取RNA時(shí)使用專門的RNase-free的槍頭和離心管。

2、TRIzol試劑具有較強(qiáng)毒性，如沾到皮膚立刻用大量的清潔劑和水沖洗！

溶液配方及原理：
1、TRIzol試劑：TRIzol能在破碎細(xì)胞、溶解細(xì)胞內(nèi)含物的同時(shí)保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。異硫氰酸胍，是一種強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。

2、氯仿：氯仿可增強(qiáng)TRIzol中的8-羥基喹啉對(duì)RNase的抑制作用。另外氯仿作為有機(jī)溶劑，加入氯仿后離心可使溶液分層，上層為水相，下層為有機(jī)相。苯酚為弱酸性，酸性條件下（一般為Ph5.0）DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，而RNA留在水相；反之亦然，弱堿性（Ph8.0）時(shí)DNA留在水相。

3、異丙醇、無(wú)水乙醇、70%乙醇：異丙醇和乙醇能與水任意比例互溶，因此加入異丙醇能夠奪取RNA周圍的水分，使其脫水沉淀。

4、DEPC水：DEPC是RNase的化學(xué)修飾劑，它與RNase的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制其活性。DEPC有毒性，操作時(shí)應(yīng)小心。誰(shuí)說(shuō)是最優(yōu)秀的；誰(shuí)是最自由的，誰(shuí)也就是最優(yōu)秀的，在他們身上，才會(huì)有最大的美。

1、細(xì)胞破碎

如果樣品中含有較多的蛋白、脂肪、多糖或其他細(xì)胞外物質(zhì)，如肌肉、脂肪組織或植物的塊根等，可在2℃~8℃，12000×g離心10 min去除這些物質(zhì)。

關(guān)于TRIzol的用量，Invitrogen官方說(shuō)明書中有建議用量：

一般情況下，根據(jù)細(xì)胞量的多少小編的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（僅供參考）

Note：TRIzol不僅僅可以提取RNA，還可以同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)！具體參見(jiàn)TRIzol官方說(shuō)明書，公眾號(hào)內(nèi)回復(fù)“TRIzol”獲取下載鏈接！

一般逆轉(zhuǎn)錄（也可稱作反轉(zhuǎn)錄）都有現(xiàn)成的試劑盒，只要大家按照試劑盒的說(shuō)明書來(lái)操作，問(wèn)題都不大，在這里小編就以TAKARA的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為例稍加說(shuō)明。

Random 6 mers為隨機(jī)的6核苷酸引物，引物序列為5'-(P)NNNNNN-3'，特點(diǎn)是產(chǎn)物量大，特異性差，適用于長(zhǎng)的或具有Hairpin構(gòu)造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在內(nèi)的所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都可使用本引物。

Oligo dT Primer適用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特異性好，但因其只結(jié)合Poly A尾巴，對(duì)于較長(zhǎng)的mRNA，經(jīng)常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。

兩種引物可據(jù)實(shí)際情況使用一種，也可同時(shí)使用。還有一種情況，當(dāng)只擴(kuò)增一種目的基因時(shí)，也可以使用Specific Primer（PCR時(shí)的下游引物）作為反轉(zhuǎn)錄引物。

步驟簡(jiǎn)述如下：按照下圖中1配制溶液，然后65℃處理后加入3中所配制溶液繼續(xù)后續(xù)反應(yīng)即可。

常用的感受態(tài)細(xì)胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提質(zhì)粒一般用DH5α，可以自己制備也可以購(gòu)買商業(yè)化的感受態(tài)。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞要現(xiàn)用現(xiàn)融，剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)轉(zhuǎn)化效率最高；
2. 避免反復(fù)凍融感受態(tài)細(xì)胞；
3. 整個(gè)操作過(guò)程要輕柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受態(tài)和連接產(chǎn)物（或質(zhì)粒）用量要適中，并不是越多越好。

1. 取50 μL感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化；

2. 加入5 μL連接產(chǎn)物（質(zhì)粒一般只需用白色槍頭沾取一下即可），混勻，置于冰上靜置30 min（此時(shí)應(yīng)該打開水浴鍋并調(diào)溫至42℃）；

3. 42℃水浴中熱激90 s，迅速置于冰上靜置2 min；

4. 加入500 μL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃，200rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1 h，使細(xì)胞復(fù)蘇；

5. 連接產(chǎn)物：3000 rpm離心5 min，棄上清，留取少量LB（50 μL左右），重懸沉淀，全部均勻涂布于LB培養(yǎng)板（需含相應(yīng)抗生素）上，37℃ 倒置培養(yǎng) 16~18h；質(zhì)粒：直接取20~50 μL涂于LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)即可。

實(shí)驗(yàn)原理：

較常用的質(zhì)粒提取方法有三種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（<15kb）。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒（>15kb）。

堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒的方法，其原理為：當(dāng)細(xì)菌暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。

由于質(zhì)粒DNA分子比染色體DNA大得多，且前者為共價(jià)閉合環(huán)狀分子，后者為線狀分子。只要堿處理的強(qiáng)度和時(shí)間不要太過(guò)，當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí)，質(zhì)粒DNA雙鏈就會(huì)再次形成。

在裂解過(guò)程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)互相纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽（SDS）包蓋。

當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來(lái)。離心除去沉淀之后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。

本方法采用Tiangen小提中量試劑盒進(jìn)行提取，其純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料，其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來(lái)。得到的質(zhì)?？梢杂糜诿盖?、PCR、測(cè)序、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)試劑（試劑盒試劑配方不清楚，以下配方見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》）

1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A

原理：Tris-Cl用于提供一個(gè)合適的緩沖體系；50 mM葡萄糖可以使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；而EDTA 作為Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，起到了抑制DNase的作用；RNase作用為去除質(zhì)粒中混有的RNA，其不受EDTA的影響。

2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS

原理：0.2 N NaOH的作用在于使細(xì)菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包蓋的細(xì)菌蛋白，染色體DNA一起作為沉淀析出。

3、溶液P3：3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸

原理：這一步的K+置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時(shí)染色體DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和堿，使溶液恢復(fù)中性，從而使質(zhì)粒DNA復(fù)性。

1、將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液（5-15ml）從搖床中取出，并擰緊蓋子，9000 rpm離心10 min，用泵盡量吸除上清。若暫時(shí)不提取，可將沉淀保存于-20℃，也可直接將菌液保存于4℃（短時(shí)間）。
注意：如果菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。

2、柱平衡步驟：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）。
注意：若柱子放置較久，需要進(jìn)行這一步驟；否則，可省。

3、向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl溶液P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，并移至2ml離心管中。如果沉淀的菌體較多，則相應(yīng)增加P1的用量（之后P2和P3的用量也應(yīng)成比例增加），并分到幾個(gè)管子中分別進(jìn)行步驟4和5的操作（不然P1+P2+P3的總體積超過(guò)2ml離心管容積），步驟6過(guò)上清時(shí)可過(guò)同一個(gè)吸附柱。
注意：菌體量以能夠充分裂解為佳，過(guò)多的菌體裂解不充分會(huì)降低質(zhì)粒的提取效率。另外，務(wù)必徹底懸浮細(xì)菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

4、向離心管中加入500μl溶液P2 ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次使菌體充分裂解。由于P2裂解不應(yīng)超過(guò)5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。故加入P2前將計(jì)時(shí)器定時(shí)4 min，以免超過(guò)時(shí)間。但是時(shí)間也不可過(guò)短，以免裂解不徹底。每管操作時(shí)間盡量一致。
注意：溫和地混合不要?jiǎng)×艺鹗?，以免污染基因組DNA 。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果未變得清亮，可能由于菌體過(guò)多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。

5、向離心管中加入700μl溶液P3（記得冰上預(yù)冷），立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）離心10 min，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。如果上清量較大，需要多次過(guò)柱，可將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以免沉淀飄起。
注意：P3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

6、將上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量為750-800μl）,注意盡量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。

7、可選步驟：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），這步省略。

8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm（-13400g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室溫靜置2-5 min，有助于更好地去除雜質(zhì)。

9、重復(fù)操作步驟8。

10、將吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR 等）實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋，置于室溫放置數(shù)min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11、將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300μl洗脫緩沖液EB（65℃預(yù)熱），室溫放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

注意：為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中．重復(fù)步驟

11、洗脫液的pH 值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內(nèi)（可以用NaOH 將水的pH 值調(diào)到此范圍）, pH 值低于7.0 會(huì)降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于100μl，體積過(guò)小影響回收效率，但也不應(yīng)過(guò)大，以免所提質(zhì)粒濃度過(guò)低，影響后面的使用。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。

結(jié)果判斷
1、使用紫外分光光度計(jì)對(duì)質(zhì)粒濃度及純度進(jìn)行測(cè)定
（1）檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm和280nm，濃度看OD260，OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml；純度看OD260/OD280，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，偏低可能是蛋白質(zhì)污染，偏高則可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，但并不表示純度低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值。另外，測(cè)出來(lái)的OD260和OD280都應(yīng)該在0.1-2.0之間，不然所得出的濃度和純度不準(zhǔn)確。

（2）應(yīng)該注意的是作為空白對(duì)照的blank管稀釋方法應(yīng)該和所測(cè)樣品管一樣（如樣品為2μl所提質(zhì)粒+48μl ddH2O，則blank為2μl洗脫液+48μl ddH2O）。

2、酶切鑒定，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
（1）選用合適的內(nèi)切酶對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行酶切，并與未切質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化用原質(zhì)粒一起用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)酶切結(jié)果及所提質(zhì)粒與原質(zhì)粒位置是否一致，可以判定所提質(zhì)粒是否為目的質(zhì)粒。

（2）所提質(zhì)粒（未酶切）的電泳條帶可能為一條帶，也可能為二到三條帶，這是因?yàn)橘|(zhì)粒提取過(guò)程中操作過(guò)于劇烈可能使環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA單鏈出現(xiàn)缺口（保持環(huán)狀，失去超螺旋），或雙鏈斷裂（變成線狀），三種構(gòu)型的質(zhì)粒分子在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率是不一樣的，因此會(huì)出現(xiàn)多條帶，這也說(shuō)明所得質(zhì)粒不夠理想。

構(gòu)建好質(zhì)粒之后我們一般先酶切鑒定，鑒定正確的可以直接拿去轉(zhuǎn)染然后做WB檢測(cè)表達(dá)即可。

可以正常表達(dá)的質(zhì)粒我們需要送到測(cè)序公司測(cè)序，也可以直接送菌液測(cè)序，有些測(cè)序公司還提供質(zhì)粒返還服務(wù)（即送菌液返還他們抽提的質(zhì)粒）。

測(cè)序的引物一般使用通用引物，如果沒(méi)有通用引物需要自行設(shè)計(jì)。常用的通用引物如下：