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手把手教你細(xì)胞RNA提取的方法

 whtjzhuhe 2017-09-15

    前面我們一塊學(xué)習(xí)了蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫蛋白的提取過程,那么研究基因的表達(dá)和調(diào)控時常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。目前常用Trizol法進行提取組織或細(xì)胞中的RNA。

    Trizol法是一種新型總RNA抽提試劑,內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞,抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

    雖然Trizol里面含有RNA酶抑制劑的,1ml的Trizol一般最多只能裂解100mg的組織。但是如果組織過量,Trizol無法完全浸潤組織無法完全裂解組織,多余組織內(nèi)的RNA酶等物質(zhì)會導(dǎo)致RNA的降解。這是RNA降解的很重要的原因。                                             

    同時,由于RNA容易降解,在實驗過程中一般都要求口罩的,避免組織的污染。同時選用的無RNA酶的進口槍頭、EP管以及DEPC水,在提取過程中,一定要時刻提醒自已RNase Free-RNase Free-RNase Free,實驗就成功一半啦~


實驗提取步驟

標(biāo)準(zhǔn)Trizol提取步驟為 液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--離心--加入氯丙醇沉淀--離心--酒精洗滌--離心。


1
將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上,加入Trizol裂解5-10分鐘,用槍頭輕輕吹打后吸取液體放入進口EP管中。

2
加入1/5體積的氯仿,上下混勻液體,4度靜置10-15分鐘。(氯仿為有機溶劑,有效的使有機相和無機相迅速分離。有機相中主要是酚和蛋白結(jié)合,從而使得蛋白和RNA脫離,RNA進入水相)。

3
4度離心15分鐘,一定注意選擇低溫離心。離心后分成三層,RNA在上清里,從離心機輕輕拿出EP管,以免管內(nèi)物質(zhì)震蕩導(dǎo)致下層沉淀激起。吸取上清的時候一定要動作輕柔,切忌吸取太多,一般吸到400-500ul,避免吸到下層沉淀,將液體置于新的EP管中。

4
加入等體積異丙醇,4度靜置10min,然后12000rpm離心10min。異丙醇主要用于沉淀RNA。

5
取出EP管后可以見到側(cè)壁沉淀,輕輕吸棄上清。

6
向EP管中加入75%酒精洗滌沉淀,幫助分離剩余的有機試劑(剩余有機試劑過多會影響OD值和PCR反應(yīng)),輕彈沉淀,使其浮在酒精,靜置1-2min,讓酒精充分接觸沉淀,充分溶解有機試劑,然后4度離心5min。輕輕吸棄上清。

7
將EP管再次放于離心機中瞬時離心,棄掉管壁殘余液體。然后將EP管置于超凈臺中干燥5-10min.。注意RNA樣品不要過于干燥,否則很難溶解。

8
加入50ul  DEPC處理水,震蕩充分溶解沉淀。

8
測量RNA濃度。將RNA保存于-80度。



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