1、使用前防范：TRIzol劇毒且易揮發(fā)（由于主要成分是苯酚），氯仿呢也是一種有毒也易揮發(fā)的試劑，有的小盆友為了防止氧化，還會(huì)加入β巰基乙醇，這個(gè)反正建議有鼻子的童鞋都做好防護(hù)。提取RNA前做好保護(hù)措施，最好在通風(fēng)廚中操作，所有接觸TRIzol的耗材，最好扔到專門的密封的桶中，等待處理。否則整個(gè)實(shí)驗(yàn)室都會(huì)彌漫著氣味，師兄師姐會(huì)打死你的！

2、必備前奏：所有耗材（槍頭、EP管）均經(jīng)過RNA酶滅活或者直接購(gòu)買無RNA酶的耗材，除RNA酶主要方法是用DEPC水浸泡48小時(shí)（DEPC雖然味道香，但卻是強(qiáng)致癌的，泡管子的時(shí)候別一直去聞它，一般來說煮沸或高溫高壓滅菌15min后，DEPC就會(huì)降解成二氧化碳和水）。順便說一句，其實(shí)我們以前也曾經(jīng)試過，濕熱滅菌兩次，也可以有效降低RNase，當(dāng)然這是偷懶的辦法啦。操作前戴口罩，你的唾沫星子是最大的RNA酶來源。

3、RNA非常容易降解，所有步驟盡量在冰盒里面操作，包括離心時(shí)需用4度預(yù)冷的離心機(jī)。根據(jù)說明書，非特別注明，所有程序均在15-30度下進(jìn)行，試劑也放置于15-30度，但是都不是溫度計(jì)的大家，還是放在冰盒上靠譜點(diǎn)。

4、1-5×10^7細(xì)胞或者50-100mg組織加入1ml TRIzol，細(xì)胞或者組織過多，TRIzol過少會(huì)導(dǎo)致裂解不充分，內(nèi)源性RNA酶抑制不完全，導(dǎo)致RNA降解。

5、TRIzol加入細(xì)胞后，反復(fù)吹打，充分裂解細(xì)胞至均一透亮，不粘稠為止。

6、加入氯仿后充分混勻，其實(shí)這步也不能過于劇烈，上層的水相含有RNA，中間的組織相含有DNA和蛋白質(zhì)，剩余的一部分DNA會(huì)萃取到氯仿中，同時(shí)氯仿具有使蛋白質(zhì)變性的作用，離心完，中間那層就是組織層。

7、離心后，溶液分層，上層為含有RNA的水相，中間層乳白色的為含有部分DNA、蛋白質(zhì)的組織層，下層紅色的為含有DNA和部分蛋白質(zhì)的氯仿, 此時(shí)，注意，“寧少勿多”，提取上層無色液體時(shí)，小心輕柔，可以用200ul的槍抽吸，一般1ml的TRIzol時(shí)最多可以提取500ml上清，但是建議提取400ul以下，千萬避免吸到中間的乳白色組織層，否則最后測(cè)量RNA時(shí)，OD260/280非常低，會(huì)有蛋白混入。

8、異丙醇加入的目的是為了使RNA沉淀，此時(shí)RNA已經(jīng)提出來了，應(yīng)輕輕混勻，避免RNA損傷。離心后肉眼可見EP管底部白色羽毛狀沉淀即為RNA沉淀，后面洗滌等操作均應(yīng)該注意，切勿將白色沉淀給倒掉，否則你就白提了。

9、75%乙醇加入的目的是為了洗滌和沉淀作用，也應(yīng)該輕柔。

10、最后晾干乙醇時(shí)應(yīng)盡量充分晾干，先用槍頭盡量把75%乙醇吸干，再晾5min,否則沒有晾干乙醇，加入DEPC水時(shí)可能導(dǎo)致RNA白色沉淀不溶解。

11、加入DEPC水溶解RNA時(shí)，可根據(jù)自己需要的濃度來調(diào)整加入DEPC水的量。

12、純的RNA的OD260/280為2.0，比值在1.8~2.0為較好結(jié)果，<1.8提示有蛋白蛋白參雜，>2.0說明RNA有降解。

13、RNA提取后可以跑瓊脂糖膠來判斷降解情況，純的無降解的RNA跑完瓊脂糖膠后應(yīng)該有3條帶，26S，18S， 5S。其中5S很淡，不容易看見。如果條帶很淡，且有拖尾現(xiàn)象，提示有RNA降解。