眾所周知，RNA提取過程中最重要的注意事項是防止RNA酶的污染導(dǎo)致實驗失敗，除此之外，本文將會整理一些實驗技巧供大家參考，幫助大家提取更高質(zhì)量的RNA。

(1)皮膚攜帶的細菌霉菌等微生物及人體自然脫落下來的皮屑，都可能成為RNA酶的來源，從而影響RNA的提取。因此要培養(yǎng)良好的無菌操作習(xí)慣，預(yù)防微生物污染。
  使用滅菌的一次性的塑料器皿提取RNA，避免使用公共儀器（公共儀器或多或少都會含有RNA酶，特別是在進行DNA操作時有時要加入RNA酶）， 消化DNA樣品中所含的RNA。用過RNA探針的實驗室，可能用RNA酶來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的公共實驗用具可能富含RNA酶。

(2)操作時勤換手套，戴手套口罩，冰上操作，動作迅速。最關(guān)鍵的一步也是決定RNA質(zhì)量的一步是：加氯仿離心后，出現(xiàn)分層，RNA在上清中，中間是DNA,下面是蛋白。這里一旦不留意，中間的DNA就會混入，從而影響RNA質(zhì)量。
  乙醇清洗后，務(wù)必完全去除乙醇（至無乙醇味），否則會影響電泳時上樣。異丙醇-20℃沉淀 RNA 30 min以上。這里要提一個小技巧，就是在加入氯仿離心后，一般上清液的量約占總體積的50%。為了提髙RNA的質(zhì)與量，離心后不要馬上吸取含有RNA的上清液，而是移取中層的DNA和下層的蛋白。余下的下層油相（10%~15%），經(jīng)短暫高速離心之后再吸取上清含有RNA的水相。因為當下層油相占很少體積時，上下層的界面所占的體積少，不會造成水相太多的浪費，吸入中間蛋白相和下層油相的可能性也會很小。其實這一技巧可用于所有的分層液相的實驗，如酚抽提DNA的實驗，回收膠中DNA的實驗。

(3)在提取細胞樣品的時候，不能在細胞離心后馬上加入Trizol試劑。因為成團的細胞加入Trizol試劑后，外圍細胞先期施放出的大分子DNA，聚積成團，干擾成團里層細胞的裂解，即使用加樣槍或針頭反復(fù)吸取，也無法徹底打斷已經(jīng)成團的DNA。
  如果提取樣品來自培養(yǎng)的貼壁細胞，吸取培養(yǎng)基后用PBS洗滌細胞兩次，直接加入Trizol試劑； 如果提取樣品來自培養(yǎng)的懸浮細胞，連培養(yǎng)基一起吸取離心，用PBS洗滌細胞兩次，最后加入5%~10%的PBS重懸細胞沉淀，等到重懸完全后再加入Trizol試劑。
  在提取組織樣品時，就得充分研磨組織，等組織塊成為粉末后再加入Trizol試劑。常用的研磨方法是液氮研磨法。因為液氮變?yōu)闅怏w時要吸收大量的熱，使組織塊瞬間冷凍。但如果冷凍不透，液氮研磨材料時，會得到干渣并黏在研缽內(nèi)壁，而不是干粉，無論是產(chǎn)量還是質(zhì)量都次之。因此，這一過程中有三個關(guān)鍵步驟：
①研磨器皿高壓滅菌烘干水汽后，-80℃放置過夜，預(yù)冷凍；
②組織塊的表面積盡可能大，切不可成球狀，一旦用力研磨，球狀的組織塊極易飛出研缽；
③加人足量的液氮讓組織塊完全凍透，一次將組織塊研磨好。在沒有凍透之前千萬不能研磨，如一次沒有研磨好，下一次研磨的效果就差，且第二次加入的液氮會將前一次所產(chǎn)生的干粉帶出研缽，使其飛濺在研缽的四周。這一技巧同樣可用于分離提取組織塊的DNA或蛋白質(zhì)。

(4)使用Trizol試劑時，其中的一種成分能抑制RNA酶，所有RNA樣品泡在Trizol試劑中是不可能被RNA酶消化的。但是，對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150℃的烘箱中烘烤4h。塑料器皿可以在0.5mol/L 的NaOH中浸泡10 min,用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。

(5)用0.01%的DEPC或Erasol水溶解RNA時，原則上是要根據(jù)沉淀的多少加入相應(yīng)的體積，考慮到新手一開始經(jīng)驗不足，可以少加，濃度大可以再稀釋。
  提取完RNA后跑電泳檢查有無DNA污染和RNA降解，然后-80℃保存。實驗后要注意：超凈臺需用70%乙醇擦拭，再用 DEPC或Erasol除去空氣中的RNase，提取RNA所需的Tip和EP管要提前用0.1%的DEPC或Erasol水處理以除去RNase，DEPC處理還需高壓。其實RNA貯存在70%的乙醇中，遠遠要比貯存于DEPC水中穩(wěn)定，在-80℃可保存數(shù)年，有些甚至10多年后還可以用。有兩種操作方式：
①乙醇或異丙醇沉淀后如不馬上要用，直接換成70%乙醇，-80℃保存，用時再來分析RNA的質(zhì)量和數(shù)量；
②常規(guī)的處理后，了解RNA的質(zhì)和量，再加入3倍體積的無水乙醇，再-80℃保存。
  當然，這兩種貯存方式都要在RNA不是馬上要用的前提下進行。如果提取的RNA比較多，可以先留取一部分樣品進行馬上進行的實驗，另一部分貯存于70%乙醇，以備后用。

(6)Trizol試劑提取RNA所用到的一次性試管要確保沒有破損，能夠耐受12000g的離心力。
  實驗用水相當重要，必須用DEPC處理過的無RNase水。配制過程是在去離子水中加入0.1%的DEPC,搖過夜之后，高壓分解殘留DEPC。。提取時，所有與Trizol試劑有過接觸的器皿都要泡存水中，吸取出來的Trizol試劑也要直接加入含有大量水的玻璃杯中。

(7)Trizol提取RNA時要注意戴手套和護眼罩，因為Trizol試劑含有酚等有機溶劑。操作要在通風(fēng)櫥完成，避免人呼吸道吸入。同時溫度應(yīng)該控制在15-30℃。