一、  關于Trizol Reagent需要的試劑

1．  Chloroform：氯仿（分析純）

2．  Isoproplyl alcohol：異丙醇（分析純）

3．  75% Ethanol（in DEPC-treated water）：75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。

4．  RNase-free water：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃過夜，并高壓滅菌即得（150℃ 3小時）

5．  一次性塑料手套

6．  注意：DEPC有致癌之嫌
二、  關于Trizol Reagent的使用過程：

1．  Homogenization（勻漿）

a.  Tissues：組織
每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。
1）  組織接入預冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細胞，置室溫5min，以使核蛋白復合物徹底分離。

（2）  加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。

（3）  4℃離心，10000g×15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當于所加的Trizol試劑量的60%。

（4）  仔細吸取上層水相，移至另一EP管中。

（5）  加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。

（6）  4℃離心，10000g×10min。RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。

（7）   棄上清液，加入預冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震蕩，充分洗滌沉淀，4℃離心，5500g×5min。棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?br>

 

 

RNA定量：

RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計比較 不同標本之間就更不準了。

RNA的貯藏，最主要的是溫度，－20不夠，最好－80，液氮最保險。

mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度的影響。

防止RNA酶污染的措施：

1.   所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

2.   塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

3.   有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。

4.   配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。

5.   操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。

6.   設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。