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TRIzol法 
試劑耗材準(zhǔn)備： RNase free的一次性帶蓋透明聚丙烯管（AXYGEN的EP管， RNase free的，拆包
即用） RNase free的槍頭（AXYGEN的RNase free的槍頭，有盒裝的和袋裝的，拆包即
用） RNase free玻璃瓶（玻璃瓶用錫箔紙包裹200°C烘烤2h，塑料瓶蓋浸泡10min的0.5
M NaOH溶液，然后用RNase free水徹底沖洗） RNase free金屬器材（200°C烘烤2h） 氯仿（國產(chǎn)分析純，比如國藥集團(tuán)產(chǎn)的） 異丙醇（國產(chǎn)分析純） RNase free水（DEPC treated水： 1） 溶解RNA及配置試劑用Invitrogen AM9916；
2） 沖洗用水自制，方法為： 把去離子水加入RNase-free玻璃瓶中，加入0.1%
（v/v） DEPC用力搖勻， 37°C過夜，高溫高壓滅菌， 滅菌時(shí)瓶口需擰松， DEPC受
高溫會(huì)分解出大量CO2，注意安全！ ） 75%乙醇（無水乙醇溶于RNase free水中） RNaseZap? RNase Decontamination Solution， Invitrogen AM9780
樣品準(zhǔn)備： 細(xì)胞樣品準(zhǔn)備：
1） 貼壁細(xì)胞：棄培養(yǎng)上清， 6 孔板 1 個(gè)孔（3.5mm）的細(xì)胞加 1ml TRIzol，室
溫裂解 10min，用槍吹打，轉(zhuǎn)移入 1.5ml RNase free EP 管。
2） 懸浮細(xì)胞：離心沉淀細(xì)胞棄培養(yǎng)基，每 5-10×106個(gè)細(xì)胞中加入 1ml TRIzol
吹打，室溫裂解 10min。 組織樣品準(zhǔn)備：
1） 50-100mg 新鮮組織，立即裝入 1.5ml EP 管，蓋緊蓋子，丟進(jìn)液氮急凍?；?br>者用 RNAlater （Invitrogen AM7020）處理。
2） 加 1ml TRIzol，冰上勻漿。
3） 室溫裂解 10min 注意：使用TRIzol試劑前避免洗滌組織和細(xì)胞，因?yàn)檫@增加了mRNA講解的可能性。全程戴手套、口罩，穿防護(hù)服！必要時(shí)戴防護(hù)眼鏡。 RNA抽提 1、 氯仿抽提： 每 1ml TRIzol 中加 200ul 氯仿，用手大力搖管 15s，室溫孵育 2-3min
4°C 離心 12000 g×15min
P.S. 離心后，混合物分離為下層紅色的有機(jī)相、中間相以及上層無色水相，RNA 存在于水相。 2、 取水相： 轉(zhuǎn)移水相到新管
P.S. 轉(zhuǎn)移水相時(shí)，槍尖隨著液面下移而下移，避免擾亂分層，慢慢吸取，避免吸到中間相和下層有機(jī)相，更不要貪心吸太多，吸大約 400ul 就好。 3、 異丙醇沉淀： 加入 600ul 異丙醇上下顛倒混勻，室溫孵育 10min
4°C 離心 12000 g×10min
P.S. 往往離心前 RNA 不可見，離心后在管側(cè)面和底部形成白色沉淀 4、 乙醇清洗： 棄上清， 加入 1ml 75%乙醇洗滌一次， 4°C 離心 7500 g×5min
P.S. 加入 75%乙醇時(shí)讓 RNA 沉淀輕輕漂起來，或者保持原位，因?yàn)橛袝r(shí)候RNA 太少，吹散了再離心下來時(shí) RNA 碎片不一定能聚集到一起形成肉眼可見的沉淀，導(dǎo)致后面的“盲操作”。 5、 晾干沉淀后溶解： 盡量吸除上清，室溫干燥 5-10min，以 DEPC treated 水溶解， -80°C 保存
P.S. 密切注意 RNA 沉淀的干燥程度，不要完全干燥，這將大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 其 A260/280 比值會(huì)偏低。最佳干燥度為 RNA 沉淀微微濕潤呈啫喱狀。 RNA質(zhì)量檢測 1、 分光光度計(jì)測定 RNA 在 260nm 處有最大吸收峰， 通過測定樣品的 OD260、 OD280，可以估計(jì)樣
品的含量和純度。 OD260 為 1 的溶液含有 40ug/ml。 純的 RNA 其 OD260/OD280 應(yīng)為 2.0，如果比值偏小，則有機(jī)溶劑或蛋白污染較
嚴(yán)重。如果比值偏大，則 RNA 可能已發(fā)生降解。 以吸光度值估計(jì) RNA 含量和純度并不十分可靠。需要結(jié)合其他方法綜合判斷。
2、 凝膠電泳法 配制 1.2%瓊脂糖凝膠。將樣品加上RNA loading buffer 后加入上樣孔電泳。電泳液用新鮮的 1×TAE 即可。 紫外下拍照可以看見 3 條帶，從上往下依次是 28s RNA、 18s RNA 和 5sRNA。其中 28s RNA 應(yīng)為 18s RNA的 2 倍且沒有涂抹狀條帶，這樣的 RNA 質(zhì)量是過關(guān)的。 吸光度測定法不能區(qū)分 DNA 和 RNA，而電泳法如果看到上樣孔內(nèi)亮亮的，那通常為污染的 DNA。如果 DNA 會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可以用 DNase 消化去除?？梢酝ㄟ^與 marker 比較估計(jì) RNA 含量。
附RNA loading buffer 配方 
好啦，今天的分享到這里就結(jié)束了！RNA抽提是一項(xiàng)非常重要且常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，充分了解，避免雷區(qū)還是很有必要的！
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