作者：檢驗(yàn)視界

作者： 李貽林 楊學(xué)習(xí) 謝冰怡 胡冬梅

基金項(xiàng)目：廣州市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ 202103000026 ）

作者單位：1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州 510515

2. 南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州 510515

3. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院產(chǎn)科，廣東，廣州 510515

通訊作者：胡冬梅

[摘 要]

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的宏基因組測(cè)序技術(shù)，對(duì)孕產(chǎn)婦的病原體不明感染性疾病的診斷尤為適用。本文對(duì)該技術(shù)在妊娠期感染性疾病中的應(yīng)用，以及關(guān)鍵環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制進(jìn)行了歸納總結(jié)。

女性懷孕后，更為容易感染各種病原體。而且，感染的早期臨床癥狀和體征易被掩蓋，這使得孕產(chǎn)婦感染性疾病的病情進(jìn)展更快速，更容易發(fā)展成更為嚴(yán)重的膿毒癥、膿毒性休克、多器官功能衰竭，甚至死亡。除外，妊娠合并感染性疾病還將對(duì)胎兒產(chǎn)生不良的影響，是導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎膜早破、死胎、胎兒生長(zhǎng)受限等的重要原因。

宮內(nèi)感染是產(chǎn)科臨床上最常見(jiàn)感染類(lèi)型，許多宮內(nèi)感染沒(méi)有任何癥狀，診斷通常比較困難，往往存在漏診、且被漏治的宮內(nèi)感染對(duì)孕母及其后代將會(huì)產(chǎn)生何種近期或遠(yuǎn)期的影響尚未可知。

臨床上炎癥指標(biāo)，例如白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量、降鈣素原、白細(xì)胞介素-6、C-反應(yīng)蛋白質(zhì)雖然對(duì)于區(qū)分感染和非感染有一定幫助，但正常孕婦也會(huì)反映出一定程度的升高。

對(duì)于感染性疾病診治的關(guān)鍵在于查找病原體。目前，臨床上用于病原體檢測(cè)的主要方法為培養(yǎng)的方法、血清學(xué)方法、病理檢查以及分子生物學(xué)方法等。然而，這些方法或多或少地存在出結(jié)果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、敏感性不夠，假陰性率高、無(wú)法直接檢出病原體、只能對(duì)已知的病原體進(jìn)行逐個(gè)排查，而不能檢測(cè)未知病原體等弊端。

宏基因組新一代測(cè)序技術(shù)(metagenomics nextgeneration sequencing, mNGS) 直接提取臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)算法，分析樣本中包含的病原微生物種類(lèi)，運(yùn)用數(shù)據(jù)比對(duì)軟件，可以快速?gòu)呐R床送檢樣品中準(zhǔn)確檢出病原微生物 [8] 。宏基因組能夠無(wú)偏倚地在同一樣本中同時(shí)檢測(cè)已知或者未知的所有病原微生物，也就是能同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、支原體、衣原體等。此外，病原檢測(cè)的敏感性更高，出報(bào)告時(shí)間更短，還可以直接分析出樣本中的病原體譜、豐度和分布情況，了解潛在病原體的變化情況等，更適用于傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果陰性的感染患者，以及免疫缺陷患者和危重癥感染患者的病原體檢測(cè) [7] 。

本文通過(guò)對(duì)mNGS檢測(cè)優(yōu)勢(shì)、實(shí)驗(yàn)流程及報(bào)告解讀規(guī)則進(jìn)行綜述，探討了mNGS在妊娠期感染性疾病中的臨床應(yīng)用價(jià)值，從而為mNGS在產(chǎn)科臨床的應(yīng)用提供了更多的理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)流程

1.1 樣本采集

1.1.1 靜脈血標(biāo)本采集

成人的采血量為4mL。采集的血液推薦存放于有游離 DNA 保護(hù)功能的無(wú)創(chuàng)專(zhuān)用采血管。

1.1.2 羊水標(biāo)本采集

如懷疑宮內(nèi)感染，可采集羊水標(biāo)本。對(duì)于懷疑胎兒感染者，可進(jìn)行臍靜脈穿刺。

1.2 核酸提取

為了提高mNGS的檢測(cè)靈敏度，可以結(jié)合臨床檢測(cè)需求，進(jìn)行人源核酸的去除。

為提高胞內(nèi)菌、真菌等的檢出率，提取前應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行破壁處理。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序

1.4 生物信息學(xué)分析

生信分析方法主要體現(xiàn)在比對(duì)方法優(yōu)化以及下游分析。為了縮短分析時(shí)間，提高分析準(zhǔn)確性，需要在速度和精度做重點(diǎn)優(yōu)化，除此之外，在計(jì)算資源、能耗、體系結(jié)構(gòu)等方面也存在著優(yōu)化空間。

1.5 出具報(bào)告

報(bào)告出具過(guò)程中應(yīng)參考疑似背景微生物庫(kù)及陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果，尤其是呼吸道定植菌，并結(jié)合所提供的臨床信息，最終給出檢測(cè)報(bào)告。檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包括檢出序列數(shù)、平均測(cè)序深度、基因/基因組覆蓋度和相對(duì)豐度等內(nèi)容。

圖3 mNGS實(shí)驗(yàn)流程和分析流程

1.6 mNGS 報(bào)告解讀規(guī)則

mNGS可同時(shí)檢測(cè)出樣本中的多種微生物，例如細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)、支原體、衣原體、螺旋體等，但mNGS的陽(yáng)性閾值受到多種因素的影響，如測(cè)序平臺(tái)、測(cè)序流程、測(cè)序數(shù)據(jù)量、樣本類(lèi)型、病原種類(lèi)、患者病情等。測(cè)序平臺(tái)在三代測(cè)序測(cè)序片段更長(zhǎng)，但是存在一定的測(cè)序錯(cuò)誤率，造成假陽(yáng)性，同時(shí)二代測(cè)序由于測(cè)序片段過(guò)短，存在親緣關(guān)系比較近的微生物無(wú)法區(qū)分，造成假陰性，故結(jié)合測(cè)序平臺(tái)質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定更符合臨床真實(shí)結(jié)果。

討論

孕婦罹患感染性疾病的病原體有多種，感染性疾病病原體及其藥敏的快速鑒定，有助于幫助臨床盡快啟用敏感的抗生素，迅速緩解癥狀、改善母兒預(yù)后，具有重要的意義[16]。

然而，滯后的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，使得初始治療一般只能經(jīng)驗(yàn)性地采用廣譜抗生素。這卻可能導(dǎo)致耐藥基因傳播、加劇多重耐藥和繼發(fā)真菌感染。而與培養(yǎng)法相比，分子診斷在病原學(xué)檢測(cè)方面有進(jìn)一步16S rRNA基因可作為菌種鑒定的分子標(biāo)記；而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）能快速準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌、真菌等微生物。

針對(duì)mNGS技術(shù)應(yīng)用于妊娠期感染性疾病，發(fā)現(xiàn)采樣對(duì)于結(jié)果影響由于重要，故針對(duì)不同的妊娠情況采集不同的樣本類(lèi)型；在報(bào)告解讀中需要臨床醫(yī)生的參與，盡量將mNGS檢測(cè)到的微生物結(jié)合患者的臨床癥狀及其他檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果綜合考慮，多學(xué)科的綜合考慮，能更好的給臨床醫(yī)生提供證據(jù)進(jìn)行診療方案的制定。

值得注意的是，雖然mNGS在產(chǎn)科中的作用巨大，但是這種方法還存在檢測(cè)費(fèi)用高、醫(yī)院難以配備這種設(shè)備、送檢較麻煩、以及過(guò)度敏感可能導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。低豐度微生物的檢測(cè)在臨床中的意義不詳、病原體檢查結(jié)果需要與臨床癥狀、體征以及輔助檢查結(jié)果結(jié)合起來(lái)進(jìn)行綜合判定等。

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排版 | 張寧

審校 | 方研