作者：Charles Y. Chiu  Steven A. Miller

文獻(xiàn)來源：Nature reviews | Genetics  https:///10.1038/s41576-019-0113-7

編譯：吉林省結(jié)核病醫(yī)院  于英杰 

臨床微生物學(xué)的范疇包括微生物診斷學(xué)和臨床樣本的病原學(xué)識別，以指導(dǎo)感染性疾病患者的管理和治療策略，以及公共衛(wèi)生微生物學(xué)、社區(qū)感染性疾病報告的監(jiān)督和監(jiān)測。傳統(tǒng)的微生物學(xué)實驗室診斷技術(shù)包括微生物培養(yǎng)和分離、識別病原體特異性抗體（血清學(xué)）或抗原，和分子生物學(xué)鑒別微生物核酸（DNA或RNA，最常見是經(jīng)由PCR）。雖然大多數(shù)分子分析使用特定的引物或探針只針對有限數(shù)量的病原體，但宏基因組學(xué)方法描述了樣本中存在的所有DNA或RNA，從而能夠分析整個微生物組以及患者樣本中的人類宿主基因組或轉(zhuǎn)錄組。宏基因組學(xué)方法已經(jīng)應(yīng)用了幾十年，主要用于描述各種生態(tài)位，范圍從海洋環(huán)境到有毒土壤，到節(jié)肢動物病載體，到人類微生物群。還用于鑒別古代遺跡中的感染、發(fā)現(xiàn)新的病毒病原體，并在健康和疾病狀態(tài)下對人類病毒進(jìn)行特征描述，也用于法醫(yī)學(xué)。

具有能夠在一份樣本中發(fā)現(xiàn)所有潛在病原體——細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲——的能力，還可以同時審視宿主反應(yīng)，這種方法具有極好地診斷感染性疾病的潛在用途。臨床宏基因組學(xué)應(yīng)用最早源自2000年代基因芯片的應(yīng)用。部分早期成功的應(yīng)用技術(shù)包括發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒、癌癥中基因突變的分析，以及人體不同部分的全面微生物分析。然而，2005年二代測序（NGS）技術(shù)的到來，使宏基因組學(xué)領(lǐng)域有了跳躍式發(fā)展。第一次，數(shù)百萬到數(shù)十億的讀取可以發(fā)生在一次運(yùn)行中，允許對臨床或環(huán)境樣本進(jìn)行完整的遺傳學(xué)分析。在隨后的十幾年中，可用測序儀的激增和測序成本的指數(shù)級下降推動了NGS技術(shù)的迅速被采用。

迄今為止，幾個研究已經(jīng)讓我們看到了NGS在臨床和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的前景。例如，利用NGS臨床診斷神經(jīng)鉤端螺旋體的14歲腦膜腦炎患兒，因為成功的診斷促進(jìn)了適當(dāng)?shù)陌邢蚩股刂委熀突颊叩淖罱K康復(fù)，首次證明了宏基因組NGS (mNGS)在提供臨床可操作信息方面的效用。公共衛(wèi)生微生物學(xué)方面的例子包括利用NGS，結(jié)合傳播網(wǎng)絡(luò)分析，調(diào)查大腸桿菌O104:H4菌株的爆發(fā)情況，并通過細(xì)菌的全基因組測序監(jiān)測食品供應(yīng)中的抗菌素耐藥性。越來越多地利用mNGS提供的大數(shù)據(jù)用于臨床目的，包括直接從臨床樣本中鑒定抗生素耐藥性，分析人類宿主反應(yīng)（轉(zhuǎn)錄組）數(shù)據(jù)，以預(yù)測感染原因和評估疾病風(fēng)險。因此，mNGS可以成為感染性病精確診斷的一個關(guān)鍵驅(qū)動因素，推動精準(zhǔn)醫(yī)療在該領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)患者個性化照料。

盡管宏基因組學(xué)的潛力和近期的成功已經(jīng)顯現(xiàn)，但由于許多因素，臨床診斷應(yīng)用一直落后于研究進(jìn)展。微生物和宿主之間復(fù)雜的相互作用影響著人類的健康，例如微生物群落在調(diào)解宿主免疫方面的作用，而且常常不清楚被檢測到的微生物是污染物、定植體還是真正的病原體。另外，缺乏通用的參考標(biāo)準(zhǔn)和證明方法來證實宏基因組分析的測試驗證、重復(fù)性和質(zhì)量保證?？紤]到成本、退還、周轉(zhuǎn)時間、監(jiān)管，以及最重要的臨床效用，臨床中常規(guī)mNGS還有很多阻礙。

迄今為止，臨床宏基因組學(xué)的應(yīng)用包括多種對綜合征和標(biāo)本類型感染性疾病的診斷、疾病和健康狀態(tài)下微生物學(xué)分析、人類宿主反應(yīng)對感染傳播的特征化，以及識別腫瘤相關(guān)病毒和他們的基因集成位置。除了感染性疾病診斷，mNGS在臨床實驗室的應(yīng)用一直比較緩慢，而且大多數(shù)應(yīng)用還沒有被納入常規(guī)臨床實踐中。盡管如此，這些應(yīng)用的廣度和潛在的臨床效能可能在不久的將來帶來微生物學(xué)診斷領(lǐng)域的改變。

感染性疾病診斷

診斷感染性疾病傳統(tǒng)的臨床程序已經(jīng)使用了一個多世紀(jì)，醫(yī)師闡述一個鑒別診斷，然后安排一系列檢查（通常是一個可能，一項檢查），試圖找出病原體。在臨床樣本中對病原體的常規(guī)檢測的范圍從鑒定培養(yǎng)中的微生物（例如，通過生化表型檢測或基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)飛行時間質(zhì)譜分析），檢測機(jī)體特異性生物標(biāo)志物（如乳膠凝集抗原檢測或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)抗體檢測）或通過PCR方法單介質(zhì)檢測或使用綜合征平板進(jìn)行多通道PCR檢測。這些平板通常包括與確定的臨床綜合征相關(guān)的最常見病原體，如腦膜炎和腦炎、急性呼吸道感染、敗血癥或腹瀉病等。

分子診斷分析提供了一種相當(dāng)有效和快速（通常小于2小時）的方法來診斷最常見的感染。然而，目前使用的幾乎所有傳統(tǒng)微生物試驗每次只能檢測一種或有限的病原體，或要求從臨床樣本中成功培養(yǎng)微生物。相比之下，雖然NGS分析目前不能在速度上與上述檢測相比——測序儀需要獨自運(yùn)行一個標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備且＞18小時——根據(jù)獨特的DNA和/或RNA序列從培養(yǎng)結(jié)果中識別或直接從臨床標(biāo)本識別，mNGS能夠檢測廣泛的病原體——病毒、細(xì)菌、真菌和/或寄生蟲。NGS方法的另一個關(guān)鍵優(yōu)勢是，測序數(shù)據(jù)可能用于額外的分析，而不僅僅是識別致病病原體，例如通過RNA測序的轉(zhuǎn)錄組分析來鑒定微生物群和并行分析人類宿主反應(yīng)。因此，NGS在診斷上的臨床應(yīng)用可能是在最難診斷的病例或免疫缺陷患者，他們可能的病原體范圍更大。最終，mNGS可能會在成本上與多通道檢測相競爭，或者作為一種預(yù)先“排除”檢測來排除感染性疾病病因。當(dāng)然，通過多通道PCR板或NGS檢測核酸本身并不能證明所鑒定的微生物是導(dǎo)致疾病的原因，這些發(fā)現(xiàn)必須在臨床環(huán)境中加以解釋。尤其是在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)非典型或新的感染性病原體應(yīng)跟進(jìn)確認(rèn)調(diào)查，如直接檢測活組織樣本，或觀察血清學(xué)轉(zhuǎn)變，或經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)或動物模型等方法，以確定其真正的致病可能性。

任何產(chǎn)生足夠核酸的體液或組織都可以進(jìn)行NGS分析，NGS分析可以是靶向的，也就是說，可以富集單個基因或基因組區(qū)域，也可以是非靶向的，就像宏基因組“霰彈槍”方法一樣，具體步驟的細(xì)節(jié)因?qū)嶒炇叶悺?/p>

臨床微生物群組分析

許多研究者現(xiàn)在使用mNGS代替16S rRNA基因靶向測序深入研究微生物群組的特征。公眾對微生物群組及其可能參與急性和慢性疾病狀態(tài)的認(rèn)識日益增強(qiáng)。然而，由于對微生物群組的復(fù)雜性及其在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用認(rèn)識不完全，目前還沒有針對疾病的診斷或治療的基于微生物組的臨床驗證。

微生物群組分析的一個未來的臨床應(yīng)用可能是艱難梭菌相關(guān)疾病的管理和治療。艱難梭菌是一種機(jī)會致病菌，可感染腸道，產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致腹瀉、脫水、敗血癥和死亡。艱難梭菌感染只發(fā)生在微生物群受到廣譜抗生素或近期胃腸手術(shù)等因素的影響的條件下。微生物群的重要性通過艱難梭狀菌感染后糞便移植可治愈80%-90%得到了驗證。在多項研究中使用mNGS來描繪微生物群的特征，促進(jìn)了細(xì)菌益生菌混合物的開發(fā)，這些益生菌混合物可作為預(yù)防或治療艱難梭菌相關(guān)疾病的“藥物”。

微生物群組的另一個潛在應(yīng)用是分析細(xì)菌的多樣性，這可以為病人的疾病是感染性還是非感染性提供線索。例如，一項針對肺炎患者呼吸道病原體鑒定的mNGS研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)培養(yǎng)證實感染的個體其呼吸道微生物群落的多樣性顯著降低。所謂菌群失調(diào)，也被證明與肥胖、糖尿病和炎性腸病有關(guān)，而處理這些微生物群組可能是治療這些疾病的一個手段。

人類宿主反應(yīng)分析

臨床mNGS通常關(guān)注微生物的讀取，然而也可用于人類宿主對感染的基因表達(dá)的研究。用于檢測臨床樣本中RNA病毒等病原體的RNA庫中的mNGS偶爾可產(chǎn)生宿主基因表達(dá)數(shù)據(jù)，用于轉(zhuǎn)錄組（RAN測序）分析。雖然RNA測序分析通常在全血或外周血單個核細(xì)胞（PBMC）樣本中進(jìn)行，但任何體液或組織標(biāo)本都可以用于這種分析。使用RNA測序分類基因表達(dá)分析被用來描述一些感染的特征，包括葡萄球菌菌血癥、萊姆病、念珠菌病、肺結(jié)核（識別潛伏和活動性疾病的風(fēng)險）和流感?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)的RNA測序數(shù)據(jù)分析已被用于癌癥分類，這些方法的轉(zhuǎn)化有望用于感染性疾病。含有有限數(shù)量宿主生物標(biāo)志物的平板正在開發(fā)中，作為流感、結(jié)核和細(xì)菌敗血癥的診斷檢測。

雖然目前還沒有基于RNA測序的檢測方法被臨床驗證用于患者，但RNA測序分析的潛在臨床影響是很高的。對與微生物活性基因表達(dá)相對應(yīng)的微生物的RNA序列進(jìn)行檢測，可能有助于區(qū)分感染與定植以及活的與死的生物體。此外，對人類宿主的RNA測序分析可用于直接從臨床樣本中識別新的或未被充分認(rèn)識的宿主與微生物的相互作用，正如先前對萊姆病、登革熱或瘧疾患者所顯示的那樣。RNA測序可能在病原體僅短暫存在的臨床病例中特別有用（如早期萊姆病或蟲媒病毒感染，包括西尼羅病毒或寨卡病毒）；類似于血清學(xué)檢查，間接診斷感染可能是基于病原體特異性的人類宿主反應(yīng)。病原體特異性宿主反應(yīng)的分析也可用于鑒別真正的致病病原體或復(fù)雜的臨床宏基因組樣本中的病原體，如多菌膿腫或呼吸道液體。然而，RNA測序另一個有前途的應(yīng)用是在鑒別急性病是否為感染性疾病方面。例如，如果根據(jù)宿主反應(yīng)判斷一種疾病更有可能是非感染性疾?。ㄈ缱陨砻庖咝约膊。R床醫(yī)生可能更愿意停止使用抗生素，并積極使用類固醇和其他免疫抑制藥物治療。隨著大規(guī)模測序數(shù)據(jù)的不斷產(chǎn)生，受常規(guī)臨床mNGS檢測的驅(qū)動，可能通過結(jié)合微生物和宿主基因表達(dá)數(shù)據(jù)來提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。

腫瘤學(xué)的應(yīng)用

在腫瘤學(xué)中，識別突變基因的全基因組或定向NGS方法可用于同時發(fā)現(xiàn)與癌癥相關(guān)的病毒（即皰疹病毒、乳頭瘤病毒和多瘤病毒）和/或收集病毒與宿主相互作用的數(shù)據(jù)。例如，mNGS在默克爾細(xì)胞多瘤病毒的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，現(xiàn)在認(rèn)為這種病毒是導(dǎo)致默克爾細(xì)胞癌（一種罕見的皮膚癌，在老年患者中最常見）的原因。迄今為止，美國食品和藥物管理局（FDA）已經(jīng)批準(zhǔn)在臨床使用兩個NGS平板測試腫瘤樣本中可執(zhí)行的基因組畸變。在這些樣本中檢測與整合病毒和外源性病毒相對應(yīng)的讀取是可能的，只要在面板中添加特定的病毒探針，或者在測序整個腫瘤基因組或外顯子組時順便完成。

整合的或活躍的病毒感染與癌癥及其參與的信號通路的額外認(rèn)知可能提供預(yù)防和治療干預(yù)措施的信息，有針對性的抗病毒和/或化療藥物就是明證，抗病毒藥物治療后丙型肝炎病毒的相關(guān)肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險降低。未來，從液體活檢樣本（如血漿）中提取的無細(xì)胞DNA mNGS可能被用于同時識別早期癌癥和診斷免疫缺陷患者的感染。

在臨床實驗室中實施mNGS是一項復(fù)雜的工作，需要使用符合法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量管理方法定制研究協(xié)議。文庫制備、測序儀器和生物信息學(xué)工具在研究環(huán)境中不斷變化。然而，在臨床實驗室中，需要按照標(biāo)準(zhǔn)化（鎖定）協(xié)議實施檢測。在對患者進(jìn)行檢測之前，對檢測方法的任何組成部分所做的更改都需要經(jīng)過驗證，并證明其具有可接受的性能。為納入中期技術(shù)進(jìn)步的NGS試劑、協(xié)議和儀器，定期更新和重復(fù)驗證研究是必要的。用于病原體檢測的宏基因組學(xué)方法對臨床驗證提出了一個特別的挑戰(zhàn)，因為要考慮驗證的分析方法，測試實質(zhì)上無限數(shù)量的不同生物體是不現(xiàn)實的。然而，可以采取一種最佳實踐方法，包括故障模式分析和使用具有代表性的生物體對性能特征進(jìn)行評估，并進(jìn)行持續(xù)的分析監(jiān)測和對意外結(jié)果的獨立確認(rèn)。

靈敏度和富集或貧化方法

mNGS的一個關(guān)鍵限制是它在高背景下的敏感性降低，不論主要來自人體宿主（例如組織活檢），還是來自微生物組（例如糞便）。背景可能與臨床相關(guān)，因為感染中的病原體載量可能非常低（<103拷貝/毫升），例如腹瀉患者糞便中的福氏志賀氏桿菌或病媒傳播的發(fā)熱性疾病患者血漿中的寨卡病毒。

已開發(fā)出用于RNA庫的宿主衰竭方法，并證明是有效的，包括提取后的DNase I處理去除殘留的人類背景DNA；使用RNA探針后進(jìn)行RNase H處理；針對人類和線粒體rRNA（臨床樣本中最豐富的宿主RNA類型）的抗體；和/或基于crispr - cas9的方法，如雜交耗盡豐富的序列。

不幸的是，還沒有一種與DNA庫同等有效的方法。利用抗甲基化的人類宿主DNA抗體，可在3-5倍范圍內(nèi)實現(xiàn)有限的富集。由于大多數(shù)病原體基因組中缺乏甲基化DNA，這種抗體可以豐富微生物的讀取。對人類細(xì)胞進(jìn)行不同程度的裂解，然后用DNase I降解背景DNA——從而保留和富細(xì)胞壁生物（包括一些細(xì)菌和真菌）的核酸——已證明可提供多達(dá)1000倍的大量微生物富集。然而，差異裂解法的性能受到許多因素的限制。這些限制包括對無細(xì)胞壁微生物的潛在敏感性降低，如支原體或寄生蟲；使用額外試劑可能增加外源性背景污染；以及無法從人體宿主免疫細(xì)胞或抗生素治療在體內(nèi)裂解的死亡生物體中檢測到游離核酸。保留從死生物體培養(yǎng)陰性樣本中檢測無細(xì)胞DNA的能力的重要性，也是為什么將疊氮碘化丙錠處理步驟用于從活生物體中選擇DNA，也是mNGS富集方法沒有臨床應(yīng)用的原因。一般來說，鑒別裂解法和疊氮碘化丙錠法都很難以高重復(fù)性的方式實施，需要臨床實驗室的驗證。

由于可用測序器的能力不斷增強(qiáng)，在某種程度上，人類宿主的背景限制可以通過蠻力來克服。例如，通過對腦組織進(jìn)行超深度測序，在患有腦炎的兒童中發(fā)現(xiàn)了一種星形病毒，雖然這種病毒在約1.34億(0.0012%)個序列中僅產(chǎn)生1612個序列。另一種提高靈敏度的方法是利用混合方法進(jìn)行富集，如使用標(biāo)準(zhǔn)引物進(jìn)行宏基因組測序。

mNGS分析的復(fù)雜性要求訓(xùn)練有素的人員和樣品處理的極端小心，以避免錯誤和交叉污染。即使在樣本采集、標(biāo)本抽樣、核酸提取、文庫制備或匯集過程中引入微量的外源DNA或RNA，也能從污染讀取中產(chǎn)生可檢測的信號。此外，實驗室的表面、消耗品和試劑都不是沒有DNA的。為進(jìn)行準(zhǔn)確的mNGS分析，通常需要維護(hù)在mNGS數(shù)據(jù)中常見的背景微生物數(shù)據(jù)庫，這些背景微生物來自于正常的菌群或?qū)嶒炇椅廴疚?。如果它們是臨床上重要的微生物，這份名單上的微生物要么不被報告，要么需要更高的閾值來報告。

臨床實驗室運(yùn)作的特點是有一個確定的工作流程和預(yù)定的人員配備水平，不太適合對比那些研究實驗室。由于樣品通常是分批處理的，批次分析的頻率是決定總周轉(zhuǎn)時間的主要因素。除非完全自動化的示例-處理系統(tǒng)都是現(xiàn)成的，濕實驗室操作mNGS需要相當(dāng)大的操作時間，以及臨床人員對分子生物學(xué)過程訓(xùn)練有素。重復(fù)的工作，如移液，以及可能無意中混淆或遺漏工作流中的關(guān)鍵步驟，都與人體工程學(xué)有關(guān)。在復(fù)雜的mNGS過程中保持高質(zhì)量對工作人員來說是有壓力的，因為在樣品處理方面的微小偏差會導(dǎo)致產(chǎn)生的結(jié)果發(fā)生重大變化。將檢測工作流程分成多個獨立的步驟，通過輪班來執(zhí)行，可以幫助避免實驗室錯誤。

參考標(biāo)準(zhǔn)

為保證mNGS分析的質(zhì)量和穩(wěn)定性，需要建立具有良好特征的參考標(biāo)準(zhǔn)和控制。大多數(shù)可用的宏基因組參考資料是高度自定義的特定應(yīng)用程序（例如，ZymoBIOMICS微生物群落微生物標(biāo)準(zhǔn)分析和細(xì)菌和真菌宏基因組）和/或?qū)Ｗ⒂谝粋€更有限頻譜的生物（例如，國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(NIST)參考材料混合微生物DNA檢測，僅包含細(xì)菌）。因此，這些材料可能不適用于非靶向mNGS分析。

由微生物池（模擬微生物群落）或其核酸組成的自定義混合物可作為外部控制，以確定mNGS檢測的檢測限度。內(nèi)部插入控制標(biāo)準(zhǔn)可用于其他NGS應(yīng)用程序，如RNAseq的轉(zhuǎn)錄組分析，外部RNA控制聯(lián)盟（ERCC）的RNA標(biāo)準(zhǔn)由合成RNA寡核苷酸組成，涵蓋核苷酸長度和濃度范圍。ERCC RNA標(biāo)準(zhǔn)的全套或部分（或其DNA等價物）可作為內(nèi)控的標(biāo)準(zhǔn)，用于控制檢測抑制，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分析定量檢測病原體的效價。然而，由于缺乏普遍接受的mNGS標(biāo)準(zhǔn)，因此很難比較不同實驗室之間的檢測性能。迫切需要標(biāo)準(zhǔn)化的參考生物體和基因組材料來促進(jìn)這種比較和確定最佳分析方法。

生物信息學(xué)挑戰(zhàn)

目前還沒有用于分析mNGS數(shù)據(jù)的用戶友好的生物信息學(xué)軟件。因此，為臨床mNGS數(shù)據(jù)分析定制的生物信息學(xué)通道仍然需要訓(xùn)練有素的編程人員來開發(fā)、驗證和維護(hù)該通道以供臨床使用。實驗室可以在本地托管計算服務(wù)器，也可以將生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)存儲轉(zhuǎn)移到云平臺。在這兩種情況下，硬件和軟件設(shè)置都可能很復(fù)雜，必須采取足夠的措施來保護(hù)患者序列數(shù)據(jù)和信息機(jī)密，特別是在云環(huán)境中。測序數(shù)據(jù)的存儲需求可以很快變得相當(dāng)大，臨床實驗室必須決定數(shù)據(jù)存儲的數(shù)量、位置和時間。

用于mNGS分析的生物信息學(xué)通道使用許多不同的算法，通常是為研究環(huán)境開發(fā)的，并由軟件開發(fā)人員不斷更新。典型的生物信息學(xué)分析通道由一系列步驟從原始輸入FASTQ文件，包括質(zhì)量和低復(fù)雜性過濾、適配器修剪，人類宿主差集、對比參考數(shù)據(jù)庫微生物鑒定，隨機(jī)序列編譯和分類學(xué)分類，在級別、族、屬和種的個體讀取和/或連續(xù)的序列讀取。必須仔細(xì)評估通道中的每個步驟，以確保數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性和完整性，并考慮到錯誤的傳播。敏感性分析應(yīng)包含電腦模擬數(shù)據(jù)和臨床樣本產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。可以自定義數(shù)據(jù)集來模擬輸入序列數(shù)據(jù)，擴(kuò)大通過電腦模擬分析檢測到的微生物的范圍。使用標(biāo)準(zhǔn)化的參考資料和NGS數(shù)據(jù)集也有助于對不同的生物信息學(xué)通道進(jìn)行比較評價。

成本注意事項

雖然在序列數(shù)據(jù)的生成方面已經(jīng)大幅度降低了成本，但是用于測序的每個樣本試劑的總成本仍然相當(dāng)高。大多數(shù)實驗室缺乏機(jī)器人設(shè)備，并建立了自動化協(xié)議，以便在一次運(yùn)行中對大量患者樣本進(jìn)行多通路處理。因此，大多數(shù)mNGS的庫準(zhǔn)備方法都是手工執(zhí)行的，因此需要大量的工作人員時間。運(yùn)行和維護(hù)生物信息學(xué)分析通道所需的額外資源也相當(dāng)可觀，為確保監(jiān)管監(jiān)督而采取的步驟也會顯著增加成本。這導(dǎo)致每分析一個樣本的總費用為幾百至幾千美元，比許多其他臨床試驗的費用都高。

為了提高產(chǎn)量和降低成本，mNGS樣品處理需要在硬件方面進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)。隨著NGS程序變得更加標(biāo)準(zhǔn)化，以及液體處理生物機(jī)器人的使用，自動化程度將不斷提高。通常，臨床mNGS擴(kuò)增前和擴(kuò)增后步驟都需要兩個生物機(jī)器人，以避免PCR擴(kuò)增子交叉污染。增加多路復(fù)用也是可行的，因為最新一代的序列器的輸出得到了極大的增強(qiáng)。然而，由于需要批量處理以及樣本工作流和計算分析方面的考慮，每次運(yùn)行大量樣本的潛在限制是臨床使用的總周轉(zhuǎn)時間更長。

管理注意事項

臨床實驗室實行嚴(yán)格管理，一般實驗室和檢測要求適用于所有病人照料相關(guān)的分子診斷分析。質(zhì)量控制是至關(guān)重要的，必須開發(fā)保證整個試驗工作流程的分析準(zhǔn)確性的方法。重要的質(zhì)量控制步驟包括初始樣本質(zhì)量檢查、庫參數(shù)（濃度和大小分布）、序列數(shù)據(jù)生成、內(nèi)部控制的恢復(fù)和外部控制的性能。持續(xù)監(jiān)測對于mNGS測定尤其重要，以驗證隨時間推移的可接受性能并調(diào)查非典型結(jié)果。通過使用樣本內(nèi)部控制、內(nèi)部運(yùn)行控制樣本、針對污染的滑動測試和定期的熟練度測試來完成監(jiān)測。通過審查病人的臨床表現(xiàn)動態(tài)變化或驗證性實驗室測試，使用正交方法進(jìn)一步調(diào)查意外或不尋常的結(jié)果。對以前在實驗室中沒有發(fā)現(xiàn)的微生物的鑒定應(yīng)進(jìn)行獨立的確認(rèn)，通常通過臨床參考或公共衛(wèi)生實驗室檢測。應(yīng)評估非典型或新生物的臨床意義，并應(yīng)報告這些發(fā)現(xiàn)并與醫(yī)師討論，同時考慮到它們的潛在致病性以及進(jìn)一步的檢測和治療方案。臨床微生物測序委員會可以通過實時電話會議召集，與臨床醫(yī)師討論mNGS結(jié)果。發(fā)現(xiàn)對公共衛(wèi)生有影響的微生物，如漢坦病毒或埃博拉病毒，應(yīng)酌情向有關(guān)公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)報告。

在參數(shù)庫制備方法、序列生成和計算生物信息學(xué)方面的技術(shù)進(jìn)步，使更快速和更全面的宏基因組分析，以及更低的成本成為可能。測序技術(shù)及其應(yīng)用不斷發(fā)展。尤其是實時測序可能替代現(xiàn)行監(jiān)測方法，實驗室已經(jīng)開始申請這些方法診斷典型感染和最終病原體暴發(fā)，最近部署的實時納米孔測序技術(shù)可以對埃博拉病毒和寨卡病毒進(jìn)行遠(yuǎn)程流行病學(xué)監(jiān)測，甚至可以在國際空間站上使用。

盡管如此，在常規(guī)病人照料中實施mNGS仍面臨巨大挑戰(zhàn)。特別是在核酸背景高或病原菌滴度極低的臨床樣本中，對病原菌檢測的敏感性降低；隨著成本的不斷下降，增加每個樣本的測序深度也只能部分緩解這種狀況。作為直接檢測方法的一種綜合，mNGS可能最終取代培養(yǎng)、抗原檢測和PCR等臨床微生物方法，但是間接過程如病毒血清學(xué)測試將繼續(xù)發(fā)揮診斷感染的關(guān)鍵作用，而培養(yǎng)和表型敏感性測試，將是研究工作的有用手段?？傊m然目前的限制表明mNGS不太可能在短期內(nèi)取代傳統(tǒng)的診斷方法，但在某些臨床情況下，它可以作為一種補(bǔ)充試驗方法，甚至是必要的方法。

雖然mNGS用于臨床照料的應(yīng)用已在多個病例報告和小病例系列中得到證實，但幾乎所有的研究都是回顧性的，尚未建立大規(guī)模前瞻性臨床試驗以評估臨床效用。前瞻性臨床研究將是至關(guān)重要的，以了解與其他方法進(jìn)行比較何時執(zhí)行mNGS和診斷率如何。例如，mNGS轉(zhuǎn)錄組方法可能使有效的治療分類成為可能，即僅對表現(xiàn)出基因表達(dá)的“感染譜”的患者使用抗菌素，而那些表現(xiàn)出“非感染譜”的患者可以采取其他治療方法。尤其需要前瞻性臨床試驗和經(jīng)濟(jì)數(shù)據(jù)證明這些相對昂貴的試驗在改善患者預(yù)后方面的成本效益，以證明其使用的合理性。這些數(shù)據(jù)還將為監(jiān)管審批和臨床報銷政策提供支持。臨床宏基因組分析在指導(dǎo)患者管理方面有效的高質(zhì)量證據(jù)，需要使用大量患者群體數(shù)據(jù)集比較相關(guān)的健康結(jié)局，生成最小潛在分析和患者選擇偏好的協(xié)議。

我們預(yù)測，在未來5年，前瞻性臨床試驗數(shù)據(jù)評估將獲得mNGS的臨床效用和成本效益；mNGS的總成本和周轉(zhuǎn)時間將繼續(xù)下降；mNGS的其他方面，如人類宿主反應(yīng)和微生物組數(shù)據(jù)的整合，將證明其臨床效用；將開發(fā)用于按鈕操作的機(jī)器人樣品處理和微流體設(shè)備；計算分析平臺將在本地和云端得到更廣泛的應(yīng)用，從而避免了對專門的生物信息學(xué)專業(yè)知識的需求；而且，至少有一些基于mNGS的傳染病診斷檢測將獲得臨床報銷的監(jiān)管批準(zhǔn)。

我們將見證mNGS的廣泛民用化，因為基因組分析不僅針對醫(yī)生和研究人員，而且通過公眾外包計劃對患者和公眾變得廣泛可用。此外，在一個病原體不斷出現(xiàn)的世界，我們預(yù)計基于mNGS的檢測將在監(jiān)測和跟蹤新的疾病暴發(fā)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)和納米孔測序等快速診斷平臺在全球的部署，將有可能在更早的階段發(fā)現(xiàn)和控制傳染病暴發(fā)，從而挽救生命并降低控制成本。在不久的將來，mNGS將不再是一種奢侈品，而是臨床醫(yī)生軍械庫中的必需品，因為我們正在與傳染病進(jìn)行永恒的斗爭。