編譯：陳佩佩，編輯：小菌菌、江舜堯。

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1、背景介紹

傳染病仍然是全世界醫(yī)療保健的重大負(fù)擔(dān)。在過(guò)去20年中，每年約有1500萬(wàn)人死于傳染病。新出現(xiàn)和重新出現(xiàn)的致命病原體，如MERS-CoV、西尼羅河病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒和拉薩病毒以及人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）等經(jīng)典病原體的傳播和多藥耐藥性的病原體（multi-drug-resistant Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae,Mycobacterium tuberculosis, etc.），使得傳染病的精確診斷和有效治療帶來(lái)的日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原體的鑒定主要依賴(lài)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)依賴(lài)性診斷技術(shù)（例如培養(yǎng)、核酸擴(kuò)增試驗(yàn)、免疫分析，以及16S rRNA基因測(cè)序和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）等較新技術(shù)。這些方法有明顯的優(yōu)勢(shì)和局限性，在處理復(fù)雜的感染時(shí)，它們往往會(huì)暴露出諸如繁瑣、耗時(shí)和有限的診斷準(zhǔn)確性等弱點(diǎn)，從而導(dǎo)致延誤或錯(cuò)過(guò)診斷。據(jù)報(bào)道， 40%的腸道感染，50%的血流感染（BSI），以及超過(guò)50%的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的傳染病的病因仍不清楚。這些未確診的病例迫使醫(yī)生開(kāi)出經(jīng)驗(yàn)性的廣譜抗生素治療方案，這將大大增加出現(xiàn)多重耐藥細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)，并增加嚴(yán)重感染患者死亡率的可能性。

下一代測(cè)序技術(shù)（mNGS）為傳染病的診斷打開(kāi)了另一扇窗戶(hù)。許多NGS儀器，如Illumina MiSeq/NextSeq/HiSeq和Life Technologies Ion PGM/Proton，允許在一次測(cè)序過(guò)程中從許多單個(gè)細(xì)菌/樣本中獲得數(shù)據(jù)（不超過(guò)2.5天）。例如，NextSeq平臺(tái)可以對(duì)每次運(yùn)行的400個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，并在1.2天內(nèi)產(chǎn)生約4億次的讀取。NGS技術(shù)的這些優(yōu)勢(shì)正在改變臨床醫(yī)生思考如何治療未確診病例的方式，從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)向基于基因組的診斷。

mNGS是一種無(wú)偏見(jiàn)分析患者樣本中微生物和宿主基因含量的有前途的技術(shù)，正迅速?gòu)难芯哭D(zhuǎn)向臨床實(shí)驗(yàn)室。大量已發(fā)表的病例報(bào)告和臨床研究表明，mNGS已成功地應(yīng)用于腦脊液、呼吸道分泌物、糞便、尿液、血液和組織等幾十種樣品。它在診斷復(fù)雜和嚴(yán)重的感染如血液感染、呼吸道感染、骨關(guān)節(jié)感染、腦炎等方面顯示出極大的優(yōu)勢(shì)（圖1A）。此外，mNGS似乎有希望用于應(yīng)變水平分型，抗菌藥物耐藥性（AMR）檢測(cè)，毒力分析，以及檢測(cè)到的病原體的系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性。越來(lái)越多的醫(yī)生認(rèn)識(shí)到這是解決感染問(wèn)題的最后手段。mNGS是否會(huì)成為臨床實(shí)驗(yàn)室下一個(gè)常規(guī)技術(shù)的問(wèn)題正在變得越來(lái)越普遍。在這篇綜述中，將首先簡(jiǎn)要介紹宏基因組學(xué)的發(fā)展，然后總結(jié)mNGS在臨床微生物學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并進(jìn)一步討論該技術(shù)用于常規(guī)診斷的可行性。

2、宏基因組學(xué)概述

宏基因組測(cè)序是利用測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物基因組（稱(chēng)為元基因組）混合物進(jìn)行的培養(yǎng)獨(dú)立分析。元基因組學(xué)最早的應(yīng)用是研究不同環(huán)境中的不可培養(yǎng)微生物，如酸性礦井排水、馬尾藻、土壤，甚至沉沒(méi)的鯨魚(yú)骨骼。最新進(jìn)展，如優(yōu)化和驗(yàn)證的工作流程，縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT）（平均48小時(shí)），敏感性提高和定制生物信息學(xué)，推動(dòng)了基因組學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入病原體鑒定的臨床實(shí)踐。在臨床微生物學(xué)領(lǐng)域，宏基因組測(cè)序被稱(chēng)為臨床宏基因組學(xué)（CMg），有著前所未有的能力從單個(gè)臨床樣本中并行捕獲任何類(lèi)型微生物的總核酸。據(jù)我們所知，2008年3月報(bào)告了第一次使用CMg進(jìn)行病原體鑒定。作者在一系列致命的移植相關(guān)疾病中發(fā)現(xiàn)了一種新的沙那病毒。在過(guò)去的5年里（從2013年開(kāi)始），盡管大多數(shù)CMg測(cè)試是基于第二代測(cè)序（大規(guī)模并行短讀測(cè)序），但基于第三代測(cè)序（單分子、實(shí)時(shí)測(cè)序）的測(cè)試已經(jīng)出現(xiàn)，并開(kāi)始用于病原體鑒定。鑒于實(shí)時(shí)測(cè)序的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)（如便攜式系統(tǒng)、快速測(cè)序等），預(yù)測(cè)它在未來(lái)的臨床應(yīng)用中必將占有很大的市場(chǎng)份額。為了幫助讀者理解這一強(qiáng)大技術(shù)的發(fā)展（圖2），本文繪制了宏基因組學(xué)進(jìn)展的簡(jiǎn)要時(shí)間表。欲了解更多信息，建議讀者參考其他介紹元基因組學(xué)歷史的出版物。

3、mNGS的臨床應(yīng)用

3.1 臨床應(yīng)用概述與前景

在2008年3月發(fā)表的一項(xiàng)回顧性研究中，Palacios等人利用無(wú)偏的宏基因組學(xué)方法，在三名接受同一器官捐贈(zèng)者器官的患者的樣本中鑒定出一種新的沙礫病毒。結(jié)果隨后通過(guò)培養(yǎng)、PCR、免疫組化和血清學(xué)分析進(jìn)行驗(yàn)證。本研究首次表明，mNGS作為一種新的工具，可以方便地鑒別急慢性傳染病的致病微生物。隨后，這項(xiàng)技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床，特別是2015年以后，mNGS報(bào)告數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)（圖1B）。到目前為止（2018年11月），來(lái)自23個(gè)國(guó)家的100多份病例報(bào)告或臨床表現(xiàn)研究表明了MNG在協(xié)助傳染病診斷方面的實(shí)用性。美國(guó)和中國(guó)在將該技術(shù)應(yīng)用于臨床實(shí)踐方面貢獻(xiàn)最大（圖1C），大多數(shù)分析（約63%）在Illumina測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行（圖1D）。mNGS已用于9種以上人類(lèi)功能系統(tǒng)感染性疾病的病原體鑒定（圖1A），主要用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)感染（圖1E）。有趣的是，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中，高達(dá)78.1%（25/32）的研究是為了實(shí)時(shí)診斷。另外，在循環(huán)系統(tǒng)感染的研究中，實(shí)時(shí)應(yīng)用的比例也比較高（35.7%，5/14）。相比之下，呼吸系統(tǒng)感染的研究數(shù)量?jī)H次于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，但只有21.4%（6/28）用于實(shí)時(shí)診斷，大多數(shù)研究（53.6%，15/28）是概念驗(yàn)證分析。這一研究分布表明，目前臨床上使用的mNGS更有可能用于無(wú)菌樣本，如腦脊液和血液。然而，在具有復(fù)雜背景的樣本中（如尿液、大便、痰液），許多嘗試仍停留在驗(yàn)證階段。

重要的是，一系列研究表明，與傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)基的方法相比，mNGS檢測(cè)可以產(chǎn)生更好的性能。例如，迄今為止最大的一項(xiàng)隊(duì)列研究（包括511個(gè)臨床樣本）表明，mNGS的檢測(cè)靈敏度（50.7%）高于培養(yǎng)（35.2%），并且受先前抗生素暴露的影響較小，與傳統(tǒng)方法相比，在免疫功能低下的mNGS患者中檢出臨床相關(guān)微生物的比例顯著高于傳統(tǒng)方法（分別為36/101和11/101，p<0.001）。此外，與超聲培養(yǎng)相比，宏基因組測(cè)序顯示出更高的物種水平敏感性88%（95%可信區(qū)間（CI），77-94%），物種水平特異性80%（95%CI，71-88%）用于假體感染病原體的鑒定。這些發(fā)現(xiàn)，再加上用戶(hù)友好、快速測(cè)序技術(shù)的日益普及，有助于將mNGS轉(zhuǎn)化為傳染病的常規(guī)診斷工具。

此外，mNGS還提供了一些新的檢測(cè)思路。例如，應(yīng)用mNGS法對(duì)3例不能耐受或拒絕支氣管鏡檢查的Pneumocystis pneumonia（PCP）患者進(jìn)行外周血標(biāo)本中的Pneumocystis jirovecii鑒定。Mai等人首次報(bào)道尿液在mNGS檢測(cè)中對(duì)診斷黃病毒性腦炎有用。這些發(fā)現(xiàn)告訴我們，mNGS可以被認(rèn)為是一種替代性的非侵入性工具，用于分析那些無(wú)法忍受侵入性操作的威脅生命的感染性病例中容易獲得的樣本（例如血液、尿液等）。然而，在現(xiàn)階段，需要更多的臨床經(jīng)驗(yàn)來(lái)支持這些新的檢測(cè)理念的實(shí)施。例如，在利用mNGS鑒定病原體時(shí)，有必要澄清哪些傳染病和這些疾病的哪個(gè)階段適合收集易于獲取的樣本。通常但不是絕對(duì)的，當(dāng)血液豐富的組織（如肺、肝等）發(fā)生局部感染或侵襲性感染（如侵襲性真菌?。r(shí)，病原體更容易進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。此時(shí)，采集的外周血樣有助于檢測(cè)病原體。更重要的是，確定用于預(yù)防感染的藥物會(huì)干擾病原體的檢測(cè)率，這對(duì)于做出準(zhǔn)確的診斷同樣重要。其他方面，如用什么樣的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)鑒別被檢測(cè)的微生物是否是真正的局部病變（如侵襲性肺炎、腦炎等）病原體，以及如何設(shè)置藥物判定水平等，也需要臨床經(jīng)驗(yàn)的積累。

總之，上述文獻(xiàn)綜述表明，盡管mNGS仍在走向成熟的道路上，但它正在逐漸被認(rèn)可，并且在不久的將來(lái)可以應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。

3.2 病原菌的檢測(cè)

目前，mNGS檢測(cè)在臨床上處于最前沿，通常是在通過(guò)顯微鏡、培養(yǎng)基、血清學(xué)或一系列樣本的分子檢查未能確定病因的情況下。換言之，只有當(dāng)病人住院數(shù)周并接受昂貴的侵入性檢測(cè)時(shí)，才考慮進(jìn)行mNGS檢測(cè)。然而，這些延遲應(yīng)用的mNGS實(shí)際上在檢測(cè)難治性感染患者的以下藥物方面表現(xiàn)良好；這項(xiàng)技術(shù)有可能成為快速可靠的病原體鑒定手段。

3.2.1 罕見(jiàn)病原體

2014年，Wilson等人報(bào)告一例罕見(jiàn)的慢性神經(jīng)肽螺旋體病，在急性發(fā)作后持續(xù)數(shù)月。傳統(tǒng)的腦脊液培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、PCR等方法均未能檢測(cè)出引起感染的罪魁禍?zhǔn)?。?dāng)在腦脊液樣本中進(jìn)行mNGS分析時(shí)，識(shí)別出了特異于Leptospira santarosai的序列，隨后的血清學(xué)檢測(cè)和PCR證實(shí)了Leptospirasantarosai的感染。2015年，臨床醫(yī)生通過(guò)mNGS分析腦脊液樣本，診斷出另一例致命性腦膜腦炎病例，并迅速發(fā)現(xiàn)了一種罕見(jiàn)的傳染源——Balamuthia mandrillaris。2018年，幾項(xiàng)研究報(bào)告成功利用mNGS管道診斷罕見(jiàn)的傳染病病原。研究報(bào)告了在一名16歲腦炎男孩的尿液中診斷出Japanese encephalitis virus病毒，異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）患者沙眼衣原體感染，Naegleria fowleri相關(guān)原發(fā)性Spirometra erinaceieuropaei 腦膜腦炎，比利時(shí)一名老年患者的西尼羅河病毒感染和一名11歲女孩的呼吸道感染。所有這些研究都說(shuō)明了基于MNG的方法識(shí)別罕見(jiàn)傳染病病因的能力。

3.2.2 新型病原體

新的包括新的病原體和新的因果關(guān)系，病原體和疾病之間的mNGS檢測(cè)。Piantadosi等人最近報(bào)道了Powassanvirus的快速識(shí)別，一種新出現(xiàn)的蜱傳黃病毒，由腦炎患者的mNGS檢測(cè)。Ai等人描述2017年7月，一名女性患者因偽狂犬病病毒（PRV）感染性眼內(nèi)炎。結(jié)果表明，PRV可能通過(guò)直接接觸豬的污染物而感染人類(lèi)。使用mNGS，Wylie等人發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌是皮膚正常菌群的一部分，是慢性腦膜炎的病因。臨床樣本中的痤瘡特異性序列比對(duì)照組多，基因組覆蓋率高，對(duì)痤瘡的治療效果也支持他們的結(jié)論。在其他典型病例中，唾液支原體被鑒定為一種新的PJI病原體，一種新的variegated squirrel 1 bornavirus病毒（VSBV-1）被鑒定為致命性人類(lèi)腦炎的起源。此外，在過(guò)去三年中，微生物如人類(lèi)pegivirus、Psychrobacter sp.310、Basidiobolusmeristosporus、人鼻病毒B91和Cache valley病毒也被報(bào)道為引起特定傳染病的新原因。這些報(bào)告大大增加了我們對(duì)微生物感染的了解。需要新的診斷方法，如mNGS，以擴(kuò)大傳染病病原體的檢測(cè)范圍。

3.2.3 難以檢測(cè)的病原體

臨床上常見(jiàn)難檢出病原體，常規(guī)檢測(cè)難以檢出。例如，肝結(jié)核（hepaticTB）是一種缺乏特定臨床表現(xiàn)，臨床上極易誤診的疾病。Ai等人首次報(bào)道了用mNGS法快速診斷結(jié)核分枝桿菌引起的局部肝結(jié)核，從而確定了mNGS檢測(cè)在不明原因肝損害診斷中的應(yīng)用前景。Pneumocystis pneumonia (PCP) 是一種嚴(yán)重的感染病，通常發(fā)生在免疫缺陷患者。zhang等最近的一項(xiàng)研究，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)方法相比，mNGS方法具有更高的PCP檢出率。在其他報(bào)告中，mNGS還顯示出強(qiáng)大的能力來(lái)診斷非典型臨床表現(xiàn)的病例，例如由豬帶絳蟲(chóng)引起的神經(jīng)囊蟲(chóng)病（NCC），以及布魯氏菌引起的神經(jīng)布魯氏菌病。

3.3.4 共感染

mNGS的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以在一次測(cè)試中同時(shí)檢測(cè)多種病原體。免疫抑制患者更有可能成為mNGS的最大受益者，因?yàn)樗麄兘?jīng)常合并感染。2016年，Sardi等人利用mNGS檢測(cè)，在兩名巴西確診的寨卡感染患者中發(fā)現(xiàn)了寨卡病毒和基孔肯雅病毒（CHIKV）的復(fù)合感染。在這兩種情況下，CHIKV結(jié)果都是通過(guò)特異性RT-PCR獨(dú)立證實(shí)的，這突出了無(wú)偏mNGS在鑒別共感染中的潛在效用。在另一項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)在腹瀉患者的糞便樣本中，艱難梭菌可以與產(chǎn)氣莢膜梭菌和四種病毒屬共存。這些微生物的存在被其他方法證實(shí)，但他們無(wú)法區(qū)分是哪種因素導(dǎo)致了疾病的表現(xiàn)。2018年，在mNGS平臺(tái)上，Li等人在一例重癥肺炎患者中同時(shí)檢測(cè)到人鼻病毒C（HRV-C）和博卡病毒1（HBoV1）。雖然抗病毒治療是有效的，但很難確定是哪種病毒導(dǎo)致了這一病例。我們的理解是，共同感染的患者表現(xiàn)出不同的免疫特性（抵抗病原體攻擊），并且病原體在不同患者中也可能表現(xiàn)出不同的毒力差異（異質(zhì)性）。隨著mNGS技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床實(shí)踐，越來(lái)越多的假定病原體可能會(huì)在個(gè)別病例中同時(shí)檢測(cè)到。只有對(duì)這些病原體的致病特性有了更深入的了解，才能回答誰(shuí)是第一，誰(shuí)是第二的問(wèn)題。

3.3.5 排除傳染病病因的能力

臨床上，在疾病評(píng)估中確認(rèn)感染和排除感染同樣重要。理論上，鑒于泛病原體檢測(cè)的特性（即能夠同時(shí)檢測(cè)樣本中存在的DNA和RNA病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)），mNGS在排除感染方面似乎比有偏見(jiàn)的普通檢測(cè)更有說(shuō)服力的方式。如前所述，許多研究表明，mNGS的診斷性能（包括負(fù)預(yù)測(cè)值（NPV））優(yōu)于常用的方法，這表明這項(xiàng)新的臨床試驗(yàn)也有排除感染的能力。在一項(xiàng)前瞻性試點(diǎn)研究中，Salzberg等人用mNGS檢測(cè)10例疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦或脊髓活檢中的潛在病原體。在5名患者中發(fā)現(xiàn)陰性或非特異性mNGS，因此確定他們沒(méi)有活動(dòng)性感染。這一結(jié)論得到了隨后的病理證實(shí)和有效的類(lèi)固醇治療的支持?？煽康年幮詍NGS結(jié)果可能有助于支持不存在感染的發(fā)現(xiàn)，這將有助于減少醫(yī)生對(duì)活動(dòng)性感染的擔(dān)憂(yōu)。隨著mNGS工作流程的進(jìn)一步優(yōu)化和臨床診斷測(cè)試準(zhǔn)確性的提高，該技術(shù)將在排除感染方面發(fā)揮更大的作用。

3.3.6 耐藥性評(píng)估

及時(shí)有效的藥物治療是抵抗感染的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的常規(guī)抗生素敏感性試驗(yàn)（AST）或抗生素耐藥基因（ARG）檢測(cè)方法通常是對(duì)分離的病原菌進(jìn)行的。這些方法耗費(fèi)時(shí)間，而且進(jìn)一步忽視了無(wú)法培養(yǎng)的細(xì)菌。mNGS具有對(duì)病原體基因組（部分或全長(zhǎng)）進(jìn)行測(cè)序的能力，因此在整個(gè)細(xì)菌群落中鑒定ARGs具有極大的吸引力。2016年，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，被忽視的精氨酸可以被mNGS檢測(cè)到。一項(xiàng)概念驗(yàn)證研究表明，在單微生物和多微生物樣本中，mNGS檢測(cè)可預(yù)測(cè)94.1%和76.5%的骨關(guān)節(jié)感染（BJI）患者的抗生素敏感性。Grumaz等人建立了完整的mNGS工作流程來(lái)診斷敗血癥患者的菌血癥。重要的是，他們毫不含糊地確定了一些讀碼，與兩個(gè)萬(wàn)古霉素耐藥基因（萬(wàn)古霉素和萬(wàn)古霉素）100%一致，這兩個(gè)基因來(lái)自萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌（VRE）菌株，經(jīng)微生物檢測(cè)證實(shí)，從而證明了mNGS用于檢測(cè)血漿cfDNA中抗生素耐藥標(biāo)記的適用性。Kirstahler等人通過(guò)整體分析鑒定眼內(nèi)炎患者的耐藥譜分離株基因組序列（WGS）組裝和宏基因組組裝。新上市的實(shí)時(shí)宏基因組學(xué)（Oxford Nanopore測(cè)序和PacBio-SMRT測(cè)序）似乎在檢測(cè)已知精氨酸是否存在方面更有優(yōu)勢(shì)。

如引言部分所述，mNGS分析也有助于進(jìn)化追蹤、菌株鑒定和毒力預(yù)測(cè)，甚至有助于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和治療效果。然而，在目前的臨床實(shí)踐中，在大多數(shù)情況下，只有當(dāng)常規(guī)檢測(cè)失敗時(shí)才考慮應(yīng)用mNGS。一項(xiàng)研究表明，在檢測(cè)常見(jiàn)的細(xì)菌感染時(shí)，mNGS并沒(méi)有表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。因此，促進(jìn)這項(xiàng)技術(shù)的日常使用是首要任務(wù)。我們必須清楚地認(rèn)識(shí)到，mNGS是一項(xiàng)正在積極發(fā)展中的復(fù)雜技術(shù)，受到許多因素（如成本、TAT、方法標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)分析工具等）的影響。最近的工作流程改進(jìn)已經(jīng)解決了許多這些障礙，隨著進(jìn)一步的努力，這種新方法將在更多的診斷實(shí)驗(yàn)室中被常規(guī)接受。

4、mNGS用于常規(guī)診斷的可行性探討

4.1 質(zhì)量保證

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中使用的典型mNGS工作流程涉及多個(gè)過(guò)程（圖3），這些過(guò)程都在不斷優(yōu)化和發(fā)展。由于在撰寫(xiě)本文時(shí)還沒(méi)有FDA批準(zhǔn)的mNGS傳染病診斷方法，一些實(shí)驗(yàn)室將樣本發(fā)送給第三方（商業(yè)）供應(yīng)商進(jìn)行測(cè)試，而其他實(shí)驗(yàn)室則構(gòu)建自己的工作流程來(lái)檢測(cè)病原體。然而，這些實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的工作流程高度個(gè)性化，只適用于特定的感染類(lèi)型或樣本類(lèi)型。許多關(guān)鍵的步驟彼此不同，包括樣品制備、試劑選擇、測(cè)序過(guò)程和最終的生物信息學(xué)管道（參考數(shù)據(jù)庫(kù)和統(tǒng)計(jì)分析）。這些工作流程缺乏方法標(biāo)準(zhǔn)化和驗(yàn)證，阻礙了評(píng)估不同實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的結(jié)果可變性的能力，導(dǎo)致最終結(jié)果的不確定性。因此，在匆忙實(shí)施mNGS測(cè)試之前，必須進(jìn)行廣泛的驗(yàn)證以確保結(jié)果準(zhǔn)確且可重復(fù)。2017年，Schlaberg、Chiu等人首次提出了在臨床實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證宏基因組病原體檢測(cè)測(cè)試的示例解決方案。他們強(qiáng)調(diào)了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室協(xié)議、數(shù)據(jù)分析算法、參考數(shù)據(jù)庫(kù)以及建立嚴(yán)格的質(zhì)量控制（QC）指標(biāo)的必要性。2018年5月，Chiu實(shí)驗(yàn)室根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案（CLIA）的要求，成功開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種用于從腦脊液中綜合診斷腦膜炎和腦炎病原體的mNGS分析方法。分析性能指標(biāo)包括檢測(cè)限、精密度、準(zhǔn)確度、干擾影響和穩(wěn)定性等。此已驗(yàn)證工作流的詳細(xì)信息顯示在網(wǎng)站上(https://nextgendiagnostics./technology/)并報(bào)道過(guò)。此外，臨床mNGS檢測(cè)的其他樣本類(lèi)型和感染的驗(yàn)證工作正在進(jìn)行中。這些實(shí)踐將使mNGS成為臨床上可用的病原體檢測(cè)手段，并為其他實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證其性能提供了一個(gè)可行的參考模型。對(duì)于任何實(shí)驗(yàn)室，必須仔細(xì)考慮制定監(jiān)管要求（即，遵守CLIA、ISO15189、CAP、歐洲指令98/79/EC的規(guī)定或其他）完全適用于臨床基因組學(xué)工作流程的驗(yàn)證；細(xì)節(jié)在別處討論。更重要的是，陽(yáng)性和陰性對(duì)照必須在驗(yàn)證階段后的整個(gè)過(guò)程中與臨床樣本一起運(yùn)行。

4.2TAT和成本

目前大多數(shù)mNGS平臺(tái)能夠在24-72小時(shí)（平均48小時(shí)）內(nèi)完成從采樣到最終結(jié)果的分析。第三代測(cè)序技術(shù)甚至可以將TAT縮短到幾個(gè)小時(shí)。大大縮短了細(xì)菌在臨床和實(shí)驗(yàn)室間的采樣時(shí)間對(duì)臨床標(biāo)本的病原鑒定。然而，最大的障礙是沒(méi)有合適的方法來(lái)顯著縮短AST的體外培養(yǎng)時(shí)間。如前所述，mNGS有能力識(shí)別所檢測(cè)病原體的ARG，一旦技術(shù)成熟，應(yīng)大大縮短藥物敏感結(jié)果的報(bào)告時(shí)間。在臨床病毒學(xué)中，特異性PCR是目前檢測(cè)病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，可以在12小時(shí)內(nèi)完成對(duì)已知病毒的鑒定。目前的無(wú)偏mNGS分析無(wú)法達(dá)到這個(gè)速度。然而，隨著快速測(cè)序技術(shù)的發(fā)展（如簡(jiǎn)化的工作流程、快速的庫(kù)準(zhǔn)備和測(cè)序、簡(jiǎn)化和快速的數(shù)據(jù)分析等），特別是隨著單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)的成熟，可以合理預(yù)測(cè)，在未來(lái)幾年內(nèi)，增強(qiáng)型鳥(niǎo)槍基因組學(xué)的診斷速度和準(zhǔn)確性將大大提高。我們期待著臨床微生物學(xué)檢測(cè)步入幾個(gè)小時(shí)的時(shí)代。

在傳染病診斷中使用mNGS是另一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。一項(xiàng)研究提到，一次測(cè)序?qū)嶒?yàn)花費(fèi)大約250美元。在中國(guó)，目前每個(gè)樣本的成本為人民幣3000元（約合400元），高于任何一種常用方法。應(yīng)該記住，許多傳染病不能用傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行診斷，這使得使用這些工具進(jìn)行病原體篩查有時(shí)成本更低。相比之下，mNGS可以在一次測(cè)試中無(wú)偏見(jiàn)地識(shí)別所有潛在的病原體，并能提供更及時(shí)的健康相關(guān)信息，這對(duì)患者康復(fù)非常重要。

4.3 測(cè)序結(jié)果的分析與討論

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，最重要的瓶頸將不再是測(cè)序，而是專(zhuān)業(yè)的分析員分析數(shù)據(jù)，做出合理準(zhǔn)確的解釋。首先，考慮到無(wú)偏和超敏感的特性，mNGS分析可以產(chǎn)生大量與多種微生物相匹配的序列。如何區(qū)分致病病原體（正常微生物和環(huán)境污染物）是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。第二，在一些培養(yǎng)陽(yáng)性的樣本中，mNGS結(jié)果可能是陰性的（即假陰性問(wèn)題）。陰性的原因包括：（1）在某些感染中，病原體載量低于mNGS的檢測(cè)限；例如腦脊液樣本中某些代表性微生物的檢出限在0.16-313cfu/ml之間。因此，mNGS分析可能會(huì)漏掉濃度很低的病原體。在病原體負(fù)荷較低的情況下，微生物核酸富集或宿主核酸耗竭是必要的。（2）在核酸提取過(guò)程中，一些病原體（如真菌）的剛性細(xì)胞壁很難被裂解，這可能導(dǎo)致核酸產(chǎn)率較低；以及（3）一些菌株在預(yù)處理過(guò)程中易受裂解試劑的DNA降解。第三，讀得最多的微生物并不總是致病菌。

由于缺乏統(tǒng)一的解釋標(biāo)準(zhǔn)，醫(yī)生對(duì)mNGS的結(jié)果持謹(jǐn)慎態(tài)度。在實(shí)踐中，根據(jù)以下線(xiàn)索或證據(jù)，mNGS發(fā)現(xiàn)的微生物通常部分或全部被視為致病因子：（i）覆蓋率（物種水平）明顯大于任何其他微生物或?qū)φ詹牧现械母采w率，或映射讀數(shù)位于微生物列表的頂部。（ii）傳統(tǒng)技術(shù)如培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、PCR、Sanger測(cè)序和組織病理學(xué)證實(shí)了這一結(jié)果。（iii）在治療過(guò)程中，序列號(hào)或讀數(shù)或病原體負(fù)荷顯著減少和（iv）經(jīng)靶向抗菌藥物治療后患者病情好轉(zhuǎn)。

4.4 其他方面

除上述三個(gè)方面外，其他過(guò)程（如取樣、核酸提取和富集、測(cè)序和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)等）也需要進(jìn)一步優(yōu)化；它們已在別處討論過(guò)。在圖4中，我們總結(jié)了臨床實(shí)驗(yàn)室有效實(shí)施mNGS技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)（圖4A），并簡(jiǎn)要描述必要的質(zhì)量管理（測(cè)試驗(yàn)證、質(zhì)量控制和能力驗(yàn)證），以幫助確保測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性（圖4B）。

5、總結(jié)

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