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感染仍是兒童目前最常見的疾病，面對一名明確感染或疑似感染的患兒，明確病灶及病原關系著整個治療的成敗和患兒的預后。常規(guī)的病原微生物檢測手段存在培養(yǎng)時間長、陽性率低、受抗生素影響、特殊病原體檢測困難等諸多缺陷，使得醫(yī)生在臨床實際工作中時常處于'盲打'或經驗性治療狀態(tài)，如果患者的治療效果不好，那么'大包圍'現(xiàn)象就很常見，尤其是在有基礎疾病和免疫狀態(tài)差的患者，不但容易出現(xiàn)藥物不良反應，還破壞了宿主的內環(huán)境，導致并發(fā)癥增多甚至治療失敗。二代測序技術(next-generation sequencing，NGS)通過獲得樣本中所有核酸片段的序列信息，經過生物信息對照，能夠在較短的時間內檢測出所有微生物的種類，自2000年以來逐漸被應用到病原微生物的診斷中來，包括引起SARS的冠狀病毒的發(fā)現(xiàn)[1]。2014年新英格蘭醫(yī)學雜志首次報告了該技術應用于腦脊液檢測鉤端螺旋體感染的病例[2]，之后該技術被越來越多的應用到臨床診斷中，然而這項技術并不能簡單地用'是'或'不是'來服務臨床，了解這項技術并恰當利用是目前臨床醫(yī)生面臨的問題，本文就二代測序技術在病原學中的診斷價值進行介紹。 1 二代測序技術的發(fā)展歷程 核酸序列測定在分子生物學研究中是一項非常重要和意義重大的技術。測序技術最早可以追溯到20世紀50年代，1977年Sanger和Coulson[3]發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Maxam和Cilbert[4]發(fā)明的化學降解法標志著第一代測序技術的誕生，以Sanger法為代表的一代測序技術測序讀長(read)可達1 000 bp，準確率高(可達99.999%)，對生物學研究具有重要意義，人類基因組計劃(Human Genome Project)就是基于第一代測序技術完成的。隨著人類基因組計劃的完成，人們開始致力于基因組功能的研究，第一代測序方法因通量低、成本高、速度慢，已經不能滿足深度測序和重復測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求，這促使了第二代測序，又稱下一代測序的誕生，其中以Roche公司的454技術，Illumina公司的Solexa、Hiseq技術，ABI公司的SoLiD技術，Helicos公司的HeliScope技術等為典型代表[5]。二代測序的讀長一般僅為幾百bp，較一代測序的讀長明顯縮短，但通量高、周期短、成本低，不同測序平臺的測序方法有所不同，在讀長和準確度方面各有優(yōu)劣，其中世界上使用量最大的二代測序儀是Illumina公司的Solexa和Hiseq平臺，核心原理是采用邊合成邊測序的方法[6]，其綜合性價比較好，測序錯誤率在1.0%～1.5%，是臨床常用的測序方法。 NGS因其成本低、高通量的特點，在過去的十多年里開展應用于很多探索性領域，如對新物種基因組的de novo測序、目標區(qū)域或全基因組重測序、轉錄組測序、宏基因組測序、表觀修飾測序等[7]。其中宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是臨床上最常見的用于病原學檢測的二代測序方法，本文著重討論mNGS在病原學診斷中的價值，不包括耐藥基因、毒力檢測、菌株分型及宿主免疫應答方面的探討。 2 mNGS如何進行病原學診斷 與傳統(tǒng)的目標性病原學檢測方法相比，mNGS方法就如同撒一張大網(wǎng)，無偏移地把標本中所有病原體的核酸(DNA或RNA)都檢測出來，將可能致病的病原菌一網(wǎng)打盡。使用二代測序來做病原學診斷有幾個基本步驟，包括樣本采集、核酸提取、文庫制備、高通量測序、生物信息分析和報告解讀。目前除了樣本采集和報告解讀需要臨床醫(yī)生操作，其余步驟大多由實驗室技術人員或測序公司操作完成。作為臨床醫(yī)生我們既要做好第一步和最后一步，也要了解中間的過程及其中的技術問題，這樣才能讀懂報告。 2.1 mNGS的樣本 用于mNGS的樣本可以是組織、體液、膿汁、灌洗液、分泌物等，樣本量根據(jù)測序需要和核酸數(shù)量級而定，樣本的穩(wěn)定性對于后續(xù)的測序十分重要，尤其是RNA的測定，一般而言樣本采集完應盡快進行檢測以避免核酸降解，雖然冷凍時DNA和RNA能夠保持完整，但凍融的過程會導致不同程度的核酸降解[8]，樣本采集過程中還應注意污染的問題。核酸的提取方法取決于樣本的類型、新鮮程度以及提取目標(DNA、RNA)，通常一個廠商會提供許多不同的提取方法。 2.2 文庫建立 文庫建立有多種方法和試劑盒，以Illumina平臺為例[9,10]，對提取出來的DNA進行片段化，通過末端修復、添加A尾、接頭連接和PCR富集形成文庫以供后續(xù)測序。對于RNA建庫常見的方法是使用隨機引物進行逆轉錄，然后第二鏈合成互補DNA(cDNA)，然后以與DNA類似的方式制備。 2.3 去除宿主基因的干擾 測序后的原始序列包含了大量的reads，由于大多數(shù)標本來源于人類，且人類基因組比微生物大得多(比細菌基因組大1 000倍)，因此臨床標本mNGS的結果通常99%以上是宿主的reads[11]，通常在生物信息分析階段會比對取出人源性核酸序列，但也有更經濟的做法是在文庫制備階段就將其去除，很多方法被用于去除宿主細胞，包括使用皂素溶解選擇性地溶解人體細胞，使宿主DNA含量下降，這種方法的前提是假設病原體的DNA在它的天然外殼中受到保護，這個外殼要么是細菌或真菌的細胞壁，要么是病毒的蛋白衣殼[12]。對于RNA，可以通過捕獲探針雜交去除大量的人類核糖體或線粒體RNA[13]，或者通過使用Cas9核酸酶選擇性地靶向消除背景的人類RNA序列[14]。 2.4 生物信息分析 生物信息分析的平臺和軟件有很多，測序后的數(shù)據(jù)需要與微生物數(shù)據(jù)庫進行對比(細菌、真菌、病毒、寄生蟲等)，參考同批次陰性質控標本排除污染，根據(jù)豐度、reads數(shù)量、基因覆蓋度等進行排序，根據(jù)檢測閾值篩選病原菌，最終得出報告。值得注意的是，并不是所有的病原體基因組數(shù)據(jù)庫都是可用的，特別是當這種微生物很罕見的時候[15]，在這種情況下如果病原體序列數(shù)在標本中足夠豐富，或者能夠獲得分離物，可以嘗試重新組裝[16,17]。 2.5 mNGS報告解讀 目前尚沒有解讀mNGS報告的標準方法。測序時可能引入其他來源的核酸，包括采集時引入的核酸、采集管內的核酸、來自環(huán)境的核酸和測序試劑中的核酸，由于這些檢測的復雜性和潛在的廣度，直接從臨床標本中解釋mNGS的結果可能很困難，需要仔細的解釋和考慮以下因素：(1)罕見病原體或新出現(xiàn)的病原體株的參考數(shù)據(jù)庫不完整；(2)參考數(shù)據(jù)庫偏向某些生物；(3)某些必須加以區(qū)分的病原體可能在遺傳學上很相似(例如分枝桿菌的種類)；(4)正常菌群的存在和試劑污染等很常見，會限制結果的特異性[18,19,20]。一份好的報告結果的生成需要預先建立質量控制和結果解釋的標準，這些標準可能包括對所有病例或滿足定義標準的病例信息的集合或具有特殊結果病例的專家評審[21]。 2.6 質量控制 文庫構建時可能會引入一些污染，比如前面提到的樣本采集中混有除樣本外其他來源的核酸；測序深度的增加往往意味著建庫時PCR擴增次數(shù)增加，會導致產生過多的重復reads使后續(xù)數(shù)據(jù)處理出現(xiàn)誤差；而且測序本身也會有一定的錯誤率。質量控制并沒有一個確定的標準，在質量控制過程中會去掉低質量的reads、切除質量差的堿基、去除一些長度過低的reads等，而這些處理相當于損失了一些信息。質量控制是信息量和信息準確度之間的一個平衡，所以質量控制并不是越嚴格越好，應根據(jù)實際情況來決定，一般來說，對基因組情況知道的越少，質量控制應該越嚴格。所以在開展的檢測項目中，必須對測序數(shù)據(jù)進行質量評估，判斷其是否達到預期的測序深度，深度不夠則必須補測，若差異太大，則必須重新測序[22]。 除了排除污染的核酸，區(qū)分定植的微生物和真正致病的微生物也非常重要，尤其是細菌感染的判斷。初期的mNGS是從無菌樣本開始應用的，比如腦脊液和腦組織切片，但即使是'無菌'的人體樣本如果進行深度的測序也可能發(fā)現(xiàn)非致病的微生物[23]。目前用于mNGS的測試樣本已經發(fā)展到如呼吸道分泌物等不同種類，這些樣本本身就含有可能的定植微生物，使得結果的分析更加復雜，故而更多的鑒別方法也隨之發(fā)展開來，例如測定宿主的免疫反應來區(qū)分[24]，還有文獻報告通過加入外源細菌來量化絕對細菌豐度的方法[25]。目前尚無單純基于測序結果判斷致病菌、污染菌或定植菌的標準，故對于測序結果的判讀需結合臨床綜合判斷。 3 mNGS技術在臨床中病原學診斷的應用 如上所述，mNGS目前是由臨床和實驗室提供的一種收費的測試，其過程混雜因素較多，不同的方法、不同的平臺、不同的質控都可能影響最后結果的價值，目前尚無統(tǒng)一的標準流程，同時目前的價格也限制了其在臨床中大規(guī)模的開展。根據(jù)現(xiàn)有文獻的案例報道，當常規(guī)檢測標準不能解釋病情時，可以考慮使用mNGS，并將其作為最后的手段來試圖識別感染過程；或者應用于危重或免疫功能嚴重受損的患者，此時及時診斷對改善預后至關重要[26]。目前已有較多報道關于mNGS技術在臨床中成功診斷出病原的案例，Simner等[26]按不同系統(tǒng)進行了列舉；Nature Reviews Genetics雜志近期發(fā)表的系統(tǒng)綜述詳細列舉了mNGS在血流感染、神經系統(tǒng)感染、呼吸系統(tǒng)感染等方面的應用情況[27]；我國學者也在不同領域報道了成功應用此技術診斷病原的案例[28,29,30]。 4 結語 二代測序技術為病原學的診斷打開了一扇新的窗戶，然而其展現(xiàn)給臨床醫(yī)生的結果是需要仔細斟酌反復求證的。感染性疾病病原診斷還是要以患者為中心，臨床起主導作用，病理學、微生物學、影像學、mNGS都是幫助我們做病原學診斷，最終還是要回到患者本身。臨床醫(yī)生要了解二代測序的相關知識，包括其存在的優(yōu)缺點及正在飛速發(fā)展的更完善的測序技術，一份好的測序結果判讀是需要臨床專家、微生物專家、生物信息專家等共同助力的。測序技術在飛速發(fā)展，我們有理由期待更快速、廉價、便捷、準確的測序技術將在未來應用于臨床感染性疾病的診斷，讓醫(yī)生有的放矢，讓患者最大程度受益。 利益沖突 利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突 參考文獻 [1] RotaPA, ObersteMS, MonroeSS, et al.Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome[J]. 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