隱球菌病的替代生物標志物可用于診斷、預(yù)后和治療決策。標準診斷方法是印度墨水顯微鏡、隱球菌抗原（CrAg）和培養(yǎng)。培養(yǎng)和顯微鏡技術(shù)可追溯到1894年，至今仍在使用。用于膠囊可視化的印度墨水測試可在離心腦脊液（CSF）中檢測到約103個CFU酵母/毫升，對HIV感染患者和非HIV隱球菌腦膜炎的敏感性分別為約60%-80%和約50%。腦脊液顯微鏡定量酵母計數(shù)的變化與定量培養(yǎng)的變化相關(guān)性很差，不能用作替代標記。

隱球菌抗原（CrAg）

使用乳膠凝集、酶免疫分析（EIA）或側(cè)流分析（LFAs）的隱球菌抗原檢測已被納入臨床實踐，在腦脊液、血清、血漿和全血中的敏感性和特異性超過95%。IMMY（Norman，OK，USA）的CrAg LFA具有當前任何即時檢測中最好的診斷性能，可檢測新生隱球菌和隱球菌格蒂變種，但無法區(qū)分。在國際上，其他非食品和藥物管理局（FDA）批準的CrAg LFA的診斷性能明顯較差。血清或血漿CrAg LFA對檢測HIV感染的腦膜炎患者的敏感性大于99.9%，然而，如果存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，盡管血清檢測陰性，CSF評估應(yīng)繼續(xù)進行。假陰性試驗在CrAg乳膠凝集和HIV陰性人群中更為常見，其中約20%的人在播散性疾病的血清中可能有假陰性CrAg。由于通過連續(xù)稀釋，CrAg滴度>1:100萬時的前區(qū)效應(yīng)可能導致CrAg LFA出現(xiàn)假陰性；但是，已經(jīng)開發(fā)出一種新的半定量CrAg LFA，消除了前區(qū)。半定量CrAg滴度的能力提供了預(yù)后信息，因為高滴度與高疾病負擔相關(guān)，并預(yù)測不良預(yù)后?？墒?，治療后CSF滴度或血清CrAg滴度的連續(xù)變化與抗真菌活性、CSF定量培養(yǎng)的變化或生存率無關(guān)；因此，縱向CrAg滴度變化不是一個有用的替代生物標志物。

早期抗真菌的活性

連續(xù)CSF定量培養(yǎng)的隱球菌酵母清除率斜率，稱為早期抗真菌活性（EFA），目前是臨床試驗中常用的工具，可作為抗真菌活性的直接標記和死亡率的替代標記。2020年，對接受相同背景誘導方案的兩性霉素B脫氧膽酸鹽和氟康唑的3個序貫試驗的738名隱球菌性腦膜炎患者進行薈萃分析，與EFA>0.20的患者相比，EFA<0.20 log10 CFU/mL/d的患者18周死亡率增加（圖1）。

圖1：腦脊液隱球菌酵母菌清除率EFA與死亡率的關(guān)系。烏干達接受兩性霉素B聯(lián)合治療時，EFA<0.20 log10 CFU/mL CSF/d的患者死亡率增加。超過這一EFA閾值可能是第二階段試驗的目標。經(jīng)Pullen等人許可復(fù)制?？s寫：CFU，菌落形成單位；CSF，腦脊液；EFA，早期抗真菌活性。

此外，EFA與HIV相關(guān)隱球菌性腦膜炎死亡率的關(guān)聯(lián)是建立在先前單獨的前瞻性研究基礎(chǔ)上的。Bicanic及其同事使用了來自4項HIV相關(guān)隱球菌腦膜炎患者試驗的匯總數(shù)據(jù)，這些患者接受兩性霉素B聯(lián)合療法或氟康唑單藥療法誘導，發(fā)現(xiàn)清除率較慢與10周死亡率相關(guān)。存活10周以上的患者的平均EFA為0.41 log10 CFU/mL/d，而死亡患者的平均EFA為0.27 log10 CFU/mL/d。2016年對27項試驗（包括2854名受試者）進行的系統(tǒng)回顧（采用不同的統(tǒng)計技術(shù)測量EFA）也發(fā)現(xiàn)平均EFA與10周生存率之間存在關(guān)聯(lián)，盡管該分析排除了EFA較差的劣質(zhì)方案，如氟康唑單藥治療。雖然隱球菌性腦膜炎的死亡率有很多影響因素，但EFA是人類抗真菌活性和全因死亡率的有效替代標志物，尤其是當EFA<0.20 log10 CFU/mL/d時。由于隱球菌定量培養(yǎng)需要3-7天才能在標準真菌培養(yǎng)基上生長，EFA是一種延遲指標，不能實時用于臨床決策。定量腦脊液培養(yǎng)方法已經(jīng)發(fā)表并交叉驗證。

其他潛在的生物標志物

對于隱球菌性腦膜炎的其他替代標記物，數(shù)據(jù)不足。兩個CSF（1，3） -β-D-葡聚糖（BDG）和薄膜陣列聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測（BioFire，Salt Lake City，UT，USA）是隱球菌病的潛在診斷標志物，但與CrAg相比，兩者在診斷上都不理想。抗真菌治療期間，腦脊液BDG的快速衰減和新生隱球菌DNA的PCR周期閾值（Ct）值的變化使這些有趣的潛在替代生物標記物成為可能。

隱球菌病替代生物標志物的總結(jié)與建議

CrAg是一種公認的診斷性生物標記物，比培養(yǎng)物更敏感。CrAg LFA最敏感。CrAg優(yōu)于BDG或PCR檢測用于診斷，但連續(xù)CSF CrAg滴度不應(yīng)用于監(jiān)測治療反應(yīng)。連續(xù)定量腦脊液培養(yǎng)（EFA）中隱球菌的腦脊液清除率是抗真菌活性的直接標志物和死亡率的替代生物標志物，目前常用于隱球菌腦膜炎臨床試驗中評估新的抗真菌策略（表1）。

表1 真菌生物標志物及其在診斷、預(yù)后或作為臨床試驗替代終點中的應(yīng)用總結(jié)（替代終點，在特定疾病及特定研究干預(yù)下，可預(yù)測金標準終點（OS）臨床獲益情況的其他終點）

侵襲性念珠菌病包括念珠菌屬（念珠菌血癥）的血流感染，可并發(fā)血液播散引起的終末器官感染，以及器官或粘膜下組織的非念珠菌感染。血培養(yǎng)分析是鑒定念珠菌血癥的金標準和最常見的方法。非侵襲性念珠菌?。ㄉ顚幽钪榫。┩ǔＭㄟ^活組織檢查或抽吸相關(guān)組織獲得樣品的培養(yǎng)，染色和/或組織病理學來診斷。較新的技術(shù)和商業(yè)上可用的方法已經(jīng)開發(fā)出來，用于比培養(yǎng)物觀察到的延遲更快的診斷。

基于培養(yǎng)的系統(tǒng)的平均檢測時間為14至38小時，并且取決于所使用的培養(yǎng)條件（大多數(shù)念珠菌屬在需氧瓶中比在厭氧瓶中生長更快）、念珠菌屬種類和每毫升樣品中循環(huán)酵母菌的數(shù)量而變化。此外，存在自動血培養(yǎng)方法的靈敏度、可靠性和及時性的限制。這些測定的靈敏度隨著接種量降低而降低（1000個酵母細胞/瓶的靈敏度為79%，100個酵母細胞/瓶的靈敏度為73%，10個酵母細胞/瓶的靈敏度為70%）。白色念珠菌的平均檢測時間為20-30小時，具體取決于瓶子類型和接種量。非白色念珠菌如光滑念珠菌可能需要相當長的時間才能生長（約80小時）。

通過使用基于培養(yǎng)的分子診斷分析，臨床醫(yī)生現(xiàn)在能夠縮短鑒定微生物的時間，并改善抗菌藥物的選擇和患者預(yù)后。例如，基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）是基于不同微生物特有的特征質(zhì)譜指紋。這項技術(shù)要求評估前在固體培養(yǎng)基上生長生物體。其他最近開發(fā)的直接對陽性血培養(yǎng)樣本進行的快速診斷包括直接從血培養(yǎng)中獲得的Biofire Direct、GenMark酵母ID、Accelerate Pheno和PNA Fish。FilmArray血液培養(yǎng)鑒定試劑盒是一種能夠辨識24種不同病原體（美國猶他州鹽湖城BioFire Diagnostics）的復(fù)合分析方法，可在約1小時內(nèi)提供結(jié)果，報告的靈敏度為96%-100%，特異性為88%-100%。

盡管檢測性能、成本和效用仍存在不確定性，但培養(yǎng)技術(shù)的局限性刺激了侵襲性念珠菌病非培養(yǎng)診斷試驗的發(fā)展。傳統(tǒng)的以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的方法可能不如新方法敏感，從而導致錯誤的解讀，即新方法不如傳統(tǒng)的“金標準”更不具特異性，盡管檢測到更多真實的陽性結(jié)果（表2）。3種非培養(yǎng)診斷試驗的數(shù)據(jù)最可靠：（1→3） -β-D-葡聚糖、念珠菌聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和血液樣本的T2Candida分析。非培養(yǎng)診斷測試指導患者管理策略尚未在臨床試驗中得到驗證。我們建議，表2中暗線范圍內(nèi)的患者群體可能是未來此類試驗的目標人群，以確定具有“假陽性”培養(yǎng)非依賴性診斷試驗（培養(yǎng)陰性）的患者是否受益于抗真菌治療，是否為真陽性。下面我們將討論如何利用現(xiàn)有知識將這些分析合理地納入患者監(jiān)護。

表2：念珠菌病非依賴培養(yǎng)診斷試驗與不完善參考標準培養(yǎng)的性能特征比較

表2改編自Clancy和Nguyen。BDG診斷念珠菌病的敏感性/特異性來自本文引用的Meta分析。PCR和T2Candida診斷念珠菌血癥的敏感性/特異性來自Meta分析以及DIRECT和DIRECT2臨床試驗。為了合理使用非培養(yǎng)獨立診斷試驗，臨床醫(yī)生必須熟悉當?shù)馗鞣N類型侵襲性念珠菌病的檢測和流行情況。非培養(yǎng)診斷測試指導患者管理策略尚未在臨床試驗中得到驗證。我們建議PPV>15%的患者群體可以作為此類試驗的目標人群，以更好地確定抗真菌治療反應(yīng)的臨床效益。高?；颊呷后w中的這些“假陽性”可能代表血液和其他培養(yǎng)陰性的深層侵襲性念珠菌病。

縮寫：BDG：1,3-β-D-葡聚糖；ICU，重癥監(jiān)護室；NPV，陰性預(yù)測值；PCR，念珠菌聚合酶鏈反應(yīng)；PPV，陽性預(yù)測值。

（1→3）-β-D-葡聚糖(BDG)

BDG是念珠菌和大多數(shù)致病真菌的細胞壁成分。沒有確鑿的證據(jù)表明由任何特定制造商的化驗方法的優(yōu)越性。大部分數(shù)據(jù)用于FDA批準的真菌試驗（Cape Cod協(xié)會、Cape Cod、MA、USA）。陽性BDG結(jié)果不能識別念珠菌種類，也不能區(qū)分念珠菌和其他真菌。如果2個或更多連續(xù)樣本對BDG呈陽性（>80 pg/mL），則性能會提高。靜脈注射免疫球蛋白、白蛋白、β-內(nèi)酰胺類抗生素或細菌感染可出現(xiàn)假陽性。

在Meta分析中，血清BDG對侵襲性念珠菌病（主要是念珠菌?。┑拿舾行院吞禺愋苑謩e為約75%-80%和約60%-80%。個別報告的表現(xiàn)差異很大，敏感性從27%到100%，特異性從0%到100%。在深部念珠菌?。ㄖ饕歉骨粌?nèi)念珠菌病）的研究中，敏感性和特異性（四分位差[IQR]）分別為65%（60%-77%）和75%（64%-75%）（表3）。由于表現(xiàn)和研究設(shè)計的異質(zhì)性，最近的Cochrane報告無法進行Meta分析或評估BDG對侵襲性念珠菌病的診斷準確性。雖然BDG水平的負斜率（如下降）與成功的治療結(jié)果相關(guān)，但侵襲性念珠菌病患者的BDG連續(xù)測量通常不進行評估；需要更多關(guān)于BDG縱向變化的數(shù)據(jù)。

表3：BDG、PCR和T2Candida在不同腹腔內(nèi)念珠菌病風險人群中的預(yù)期表現(xiàn)

表3改編自Clancy和Nguyen。BDG診斷腹腔內(nèi)念珠菌病（最常見的深層念珠菌?。┑拿舾行?特異性值是本文引用研究的中值。如文中所述，PCR和T2Candida診斷的敏感性和特異性是最近發(fā)表的研究的代表。為了合理使用非培養(yǎng)診斷試驗，臨床醫(yī)生必須熟悉當?shù)馗鞣N類型侵襲性念珠菌病的試驗表現(xiàn)和流行情況。PPV和NPV分別>15–30%和>85%表示非培養(yǎng)試驗可能具有最大臨床效用的患者，假設(shè)抗真菌治療在念珠菌感染≥15%-30%的閾值可能性是合理的。

縮寫：BDG：1,3-β-D-葡聚糖；GI，胃腸道；NPV，陰性預(yù)測值；PCR，念珠菌聚合酶鏈反應(yīng)；PPV，陽性預(yù)測值。

PCR

PCR與BDG相比具有潛在優(yōu)勢，它可以特異性地靶向念珠菌屬，并允許在菌種水平上同時進行鑒定。大多數(shù)PCR檢測的目標是白色念珠菌、光滑念珠菌、副硅藻菌復(fù)合體、熱帶念珠菌和克魯氏念珠菌，它們占大多數(shù)中心侵襲性念珠菌病病例的95%以上。在一項Meta分析中，PCR對已證實/可能的侵襲性念珠菌?。ㄖ饕悄钪榫。┑拿舾行詾?5%，特異性為92%。對已證實/很可能的/可能的侵襲性念珠菌病的敏感性和特異性分別為73%和95%。全血（與血清相反）和念珠菌或真菌特異性檢測的敏感性更高，而不是更廣泛的多重檢測。念珠菌定植患者的特異性有降低的趨勢。另一項Meta分析調(diào)查了LightCycler SeptiFast（德國曼海姆羅氏診斷公司），這是一種實時多重PCR檢測法，用于檢測5種最常見的念珠菌屬和20種其他細菌病原體，這些病原體均為擬診的膿毒癥患者。本研究中，念珠菌血癥的敏感性和特異性分別為61%和99%。在深部念珠菌?。ㄖ饕歉骨粌?nèi)念珠菌?。┑难芯恐校琍CR的敏感性和特異性分別為25%-91%和33%-97%。

T2Candida

T2Candida（T2 Biosystems，Lexington，MA，USA）是美國食品和藥物管理局批準的念珠菌血癥診斷方法，通過T2磁共振檢測擴增DNA靶點的自動化過程，檢測全血中5種最常見的念珠菌。在多中心研究中，目標念珠菌對T2Candida的敏感性為89%–91%，特異性為98%。念珠菌檢測和菌種鑒定的平均時間為4.4±1.0小時。臨床實踐中T2Candida的數(shù)據(jù)顯示，該方法對念珠菌血癥的敏感性為65%-83%，特異性為93%-96%。對于深部念珠菌?。ㄖ饕歉骨粌?nèi)念珠菌病）的診斷，研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的敏感性為33%-45%，特異性為93%-96%。

在對有侵襲性念珠菌病風險的重癥監(jiān)護病房患者進行的小型研究中，基于血清BDG和T2Candida結(jié)果的治療策略可有效縮短侵襲性念珠菌病的適當治療時間，安全地減少不必要的經(jīng)驗性抗真菌藥物使用，并降低成本。在西班牙的一項針對接受念珠菌血癥治療的患者的多中心研究中，在念珠菌血培養(yǎng)陽性后的前5天內(nèi)，T2Candida陽性（而非BDG）是導致致死或發(fā)展為深部念珠菌病的獨立危險因素。在一項多中心配對研究中，經(jīng)驗性治療后T2Candida陽性是死亡或已證實念珠菌病的獨立預(yù)測因子，而BDG結(jié)果不能預(yù)測死亡率。需要進行非培養(yǎng)診斷試驗的臨床試驗-指導治療策略，以驗證對患者預(yù)后、抗真菌藥物使用和醫(yī)療成本的影響。CandiSep試驗（NCT02734550，下文討論）的結(jié)果有望增加我們對這些試驗及其對抗真菌處方的影響的理解。

非培養(yǎng)診斷試驗有可能成為念珠菌病試驗的納入標準。很明顯，單純培養(yǎng)只能檢測臨床疾病的一部分。在臨床試驗中，培養(yǎng)陽性應(yīng)該是一個重要的先驗亞組，但將登記范圍限制在培養(yǎng)陽性病例會導致登記延遲，并且人工篩選人群不能反映當前的臨床實踐。CandiSep前瞻性隨機多中心試驗正在評估與標準監(jiān)護相比，在（1,3）-β-D-葡聚糖指導下開抗真菌藥的決定是否縮短了抗真菌治療的時間并降低了死亡率。該試驗的結(jié)果應(yīng)為今后的念珠菌病試驗提供納入標準。最有可能的是，在未來的臨床試驗中，培養(yǎng)陽性/陰性應(yīng)該是先驗亞組分析的標準，而不是作為納入標準的限制。

還需要驗證替代標記物（如BDG或PCR Ct值）或T2Candida陰性時間的系列變化的臨床作用。除1項BDG研究外，替代標記物的快速減少與臨床生存率之間缺乏相關(guān)性。替代標記物動力學的驗證將允許對新藥物或聯(lián)合療法進行較小的II期試驗。一個出發(fā)點是利用現(xiàn)有的儲存標本隊列來研究生物標志物的縱向變化。

念珠菌病替代生物標志物的總結(jié)和建議

培養(yǎng)仍然是念珠菌病診斷的支柱，但不應(yīng)成為侵襲性念珠菌病試驗的限制性納入標準。有記錄的念珠菌清除率是成功抗真菌治療的標志。我們建議對陽性培養(yǎng)物進行分子診斷性分析，以準確、快速地鑒定菌種水平。在選定的臨床方案中，非培養(yǎng)診斷測試可能有助于啟動或降低抗真菌治療。對有念珠菌病危險因素的患者進行PCR或T2Candida檢測陽性證明了參與臨床試驗的必要性。存在多種可能的生物標記物，可用于II期試驗以量化抗真菌活性，但這些生物標記物尚未得到驗證。

曲霉在環(huán)境中普遍存在，經(jīng)常被吸入呼吸道。當氣道培養(yǎng)物呈陽性時，診斷侵襲性曲菌病需要合適的宿主和相容的臨床綜合征，以區(qū)分定植和感染。只有從無菌部位培養(yǎng)該菌，或在組織病理學上證明該菌具有菌絲入侵，才能證實已證實的曲霉病。曲霉細胞壁含有多糖、BDG、幾丁質(zhì)和其他可用于檢測患者樣本的成分。半乳甘露聚糖和BDG是這些細胞壁成分中研究最充分的。

半乳甘露聚糖動力學

血清半乳甘露聚糖的動力學特征復(fù)雜，取決于多種因素，包括生產(chǎn)和分泌、真菌負荷、中性粒細胞的存在和功能、患者的腎功能和肝功能，接觸具有抗曲霉屬半乳甘露聚糖活性的抗真菌藥物，循環(huán)中半乳甘露聚糖的存在與曲霉通過肺毛細血管的侵襲性生長相關(guān)，血管侵襲與真菌負荷和半乳甘露聚糖的產(chǎn)生相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)有助于解釋血清半乳甘露聚糖在不同患者群體中的不同表現(xiàn)（表4）。例如，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者和疾病負擔較高的異基因造血干細胞移植受者中可檢測到血清半乳甘露聚糖。相比之下，在實體器官移植患者中，血清半乳甘露聚糖在診斷侵襲性曲霉菌?。↖A）方面的表現(xiàn)相對較差，這些患者的疾病負擔通常較低。

表4。使用ODI截止值為1.0的血清或血漿中半乳甘露聚糖性能特征總結(jié)

表由Scott等人修改。

縮寫：ODI，光密度指數(shù)。

研究人員還關(guān)注起始血清半乳甘露聚糖值是否與患者預(yù)后相關(guān)，以及連續(xù)半乳甘露聚糖光密度指數(shù)讀數(shù)的斜率是否與生存率相關(guān)。多項研究評估了起始血清半乳甘露聚糖作為曲霉病治療反應(yīng)和預(yù)后指標的作用。在最近對這些研究的綜述中，Mercier等人發(fā)現(xiàn)血清半乳甘露聚糖陽性（定義為臨界值>0.5光密度指數(shù)）的患者在治療42天和180天時血清半乳甘露聚糖水平與生存率之間存在相關(guān)性，≥2.0起始光密度指數(shù)與預(yù)后不良有關(guān)。在最近一項比較阿尼芬凈聯(lián)合伏立康唑與單用伏立康唑的隨機對照試驗中，起始血清半乳甘露聚糖也是6周生存率的獨立預(yù)測因子。

在幾項研究中已經(jīng)評估了連續(xù)測量半乳甘露聚糖在IA患者中的作用。盡管這些研究在結(jié)果定義和半乳甘露聚糖評估時間點方面存在異質(zhì)性，但數(shù)據(jù)表明血清半乳甘露聚糖值下降是生存率的預(yù)測因子，而血清半乳甘露聚糖持續(xù)升高與死亡相關(guān)。一項研究報告說，從起始到第2周，半乳甘露聚糖光密度指數(shù)每增加0.1個單位，相當于不滿意的臨床應(yīng)答率高21%。

關(guān)于特定抗真菌藥物對血清半乳甘露聚糖動力學影響的數(shù)據(jù)是相互矛盾的，仍然是一個研究的主題。一些研究顯示了取決于抗真菌藥物的不同動力學特征，而另一些則沒有顯示出影響。

支氣管肺泡灌洗（BAL）液中的半乳甘露聚糖動力學知之甚少，應(yīng)謹慎解讀，因為該試驗受到包括取樣誤差、非標準化BAL液收集和感染部位在內(nèi)的困擾。

根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，目前美國傳染病學會指南建議，僅在血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者和起始半乳甘露聚糖升高的造血干細胞移植受者中使用連續(xù)血清半乳甘露聚糖，以監(jiān)測疾病進展、治療反饋和預(yù)測IA患者的預(yù)后。

橫向流動分析的發(fā)展有助于曲霉病的診斷，盡管它們在連續(xù)取樣中的作用迄今尚未確定。

（1→3）-β-D-葡聚糖(BDG)

BDG檢測在IA患者的治療監(jiān)測中的實用性表現(xiàn)不佳。Pazos等人首先在40例高危中性粒細胞減少患者的回顧性隊列中評估BDG與半乳甘露聚糖檢測的比較（5例證實，3例極有可能，3例可能）。半乳甘露聚糖和BDG檢測的敏感性、特異性以及陽性和陰性預(yù)測值幾乎相同；然而，BDG陽性時間早于半乳甘露聚糖。在評估BDG檢測作為預(yù)后工具時，血漿濃度在臨床和微生物學證據(jù)顯示疾病之前持續(xù)增加，但是在抗真菌治療反應(yīng)之后降低并變?yōu)殛幮浴Ｏ喾?，對抗真菌治療無反應(yīng)的患者表現(xiàn)出BDG陽性的持續(xù)存在。其他類似的研究也觀察到在治療反應(yīng)后BDG值下降。

還有人將BDG和半乳甘露聚糖直接用于IA的預(yù)后。在一項對51名可評估患者的研究中，當BDG和半乳甘露聚糖被總結(jié)時，從起始到第12周的變化之間存在關(guān)聯(lián)；然而，單獨使用BDG沒有統(tǒng)計學意義。其他人也描述了類似的發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者在6-12周內(nèi)的BDG值持續(xù)>80 pg/mL，并且軌跡不能預(yù)測6或12周的結(jié)果。BDG動力學緩慢，可能需要在治療開始后＞4-6周才能明顯改變。這些限制以及BDG檢測的患者內(nèi)變異性促使作者不推薦連續(xù)BDG。

PCR

美國曲霉PCR檢測的可用性仍然有限；PCR僅在基準實驗室進行（盡管歐洲市場上有曲霉PCR檢測）。鑒于不同的技術(shù)、陽性的周期閾值、微生物靶點和已評估的研究人群，報告的PCR性能特征有所不同。一項Meta分析評估了25項研究，發(fā)現(xiàn)綜合敏感性和特異性分別為84%和76%。在2例PCR結(jié)果陽性的患者中，靈敏度為64%，但特異性提高到95%。

很少有研究評估連續(xù)PCR檢測的預(yù)后；然而，已發(fā)現(xiàn)診斷時以血清復(fù)制數(shù)/毫升為單位的定量PCR可預(yù)測90天死亡率。持續(xù)陽性或出現(xiàn)陰性檢測可預(yù)測30天或90天的死亡率。在第14天到第20天之間PCR呈陰性的患者在第30天全部存活，而持續(xù)PCR的患者在第30天的死亡率為80%。以每周采樣為終點的PCR陰性時間可能是未來的研究領(lǐng)域。

來自BAL的煙曲霉定量PCR已被用于侵襲性和非侵襲性曲霉菌病的診斷和預(yù)后評估。在一項評估613名高危患者的4年回顧性研究中，診斷時的真菌負荷（復(fù)制數(shù)/毫升）可預(yù)測90天死亡率，500復(fù)制數(shù)/毫升以下患者的死亡率為23%，而500復(fù)制數(shù)/毫升以上患者的死亡率為68%（P<0.05）。

曲霉菌病替代生物標志物的總結(jié)和建議

半乳甘露聚糖、BDG和PCR是臨床實踐中使用的標準診斷方法，一些PCR試驗還具有檢測抗真菌耐藥性突變的優(yōu)勢。BDG的特異性最低，不足以作為患者進入臨床試驗的診斷生物標志物。對于抗真菌藥物反應(yīng)的預(yù)后標志物，血液半乳甘露聚糖值隨時間的變化是一個有前途的連續(xù)替代標志物。隨著時間的推移，PCR陰性也有望用作患者預(yù)后的替代標記。

由毛霉菌、鐮刀菌、絲孢菌屬等引起的非曲霉菌侵襲性感染在日益增多的嚴重免疫抑制患者中越來越多見，在尸檢研究中占侵襲性霉菌感染的10%-25%，且在接受抗真菌預(yù)防的患者中更為常見。這些霉菌的特點是對多種抗真菌藥物耐藥，組織入侵的可能性高，早期傳播效果差。雖然宿主相關(guān)因素（基礎(chǔ)疾病的活動性、合并癥）對死亡率很重要，但早期診斷可以防止感染演變?yōu)槎嘣钚曰虿ド⑿愿腥尽?/p>

由于非曲霉菌侵襲性感染的癥狀、體征和影像學表現(xiàn)缺乏敏感性和特異性，診斷往往延誤，導致治療延遲和不良結(jié)果。對這些霉菌感染早期有效治療的重要性知之甚少，但毛霉菌病除外，已證明早期使用抗毛霉菌治療可提高生存率。傳統(tǒng)的診斷確認需要有創(chuàng)性的操作，如活檢或BAL，這在嚴重全血細胞減少的患者中通常是不可行的。

這些病原體的商用生物標記物的性能也存在問題。除曲霉菌外，半乳甘露聚糖由幾種非曲霉菌產(chǎn)生，尤其是其他透明絲孢菌，如鐮刀菌屬。毛霉菌病患者的半乳甘露聚糖呈陰性。大多數(shù)非曲霉侵入性霉菌感染的高危患者是已經(jīng)接受抗曲霉抗真菌藥物的突破性感染。最后，雖然BDG不能在物種水平上識別生物體，但陽性BDG可以表明存在霉菌。關(guān)于非曲霉霉菌的縱向預(yù)后數(shù)據(jù)還需要更多的數(shù)據(jù)。

開發(fā)不依賴培養(yǎng)物的生物標志物來早期診斷這些重要的生物體是至關(guān)重要的。以毛霉為靶點的血清和/或BAL中基于PCR的診斷領(lǐng)域最為發(fā)達。一些小型研究表明，盡管缺乏與標準微生物學方法的詳細比較，但有希望實現(xiàn)早期診斷的高靈敏度和特異性。在一項小型研究中，通過實時定量PCR對重癥燒傷患者的循環(huán)毛霉DNA進行靶向篩查，以識別侵襲性傷口毛霉菌病，提出了降低死亡率的方法。還需要其他創(chuàng)新方法，可能包括血清學評估、揮發(fā)性有機化合物或其他代謝組學檢測，以及在選定的非曲霉菌侵襲性感染病例中驗證抗原測試、免疫組織化學、PCR和宏基因組測序。

迄今為止，診斷和預(yù)后應(yīng)用的最佳例子是在刺突嗜血桿菌腦膜炎暴發(fā)中，PCR和BDG用于CSF診斷，CSF BDG水平可用于監(jiān)測抗真菌治療的反應(yīng)。我們?nèi)孕枰嗟臄?shù)據(jù)來研究對其他霉菌治療的反應(yīng)。

非曲霉菌中替代生物標記物的總結(jié)和建議

非曲霉菌的診斷需要進一步發(fā)展，這些微生物的特定生物標記物將有助于疾病管理。關(guān)于在臨床試驗中使用任何替代終點的效用，數(shù)據(jù)不足。

典型的芽生菌病治療成功的終點是臨床改善以及皮損或放射學檢查結(jié)果的解決。診斷可能的芽生菌病的標準方法是芽生菌抗原，該抗原測量尿液、血清或體液中皮炎芽生菌（美國印第安納波利斯米拉維斯塔實驗室）的細胞壁多糖（半乳甘露聚糖）（表5）。然而，跟蹤感染過程進行縱向抗原測量的報道并不多見。三名芽生菌病兒童在治療期間進行了一系列尿抗原檢測。2名治愈患者的抗原水平下降至無法檢測，但第三名患者對抗真菌治療無反應(yīng)，抗原陽性持續(xù)存在。

一種更系統(tǒng)的方法是使用芽生菌抗原檢測來跟蹤病程，包括19名患者進行了一系列尿液抗原檢測?？乖较陆?，但在16名成功治療的患者中，出現(xiàn)陰性結(jié)果的時間差別很大。在3名治療失敗的患者中，尿抗原水平升高。

芽生菌病替代生物標志物的總結(jié)和建議

目前還沒有足夠的數(shù)據(jù)推薦芽生菌病預(yù)后的生物標志物或作為臨床試驗的替代終點。血清芽生菌抗原的縱向變化需要進一步研究。對于芽生菌病致急性呼吸窘迫綜合征的更嚴重疾病表現(xiàn)的預(yù)后需要替代標志物。

過去對球孢子菌病的研究使用了綜合臨床評分、放射學結(jié)果和血清學結(jié)果來確定臨床嚴重程度的綜合評分。可以使用多種方法進行血清學檢測（圖2）。EIA似乎具有最高的靈敏度，盡管它容易出現(xiàn)假陽性，并且結(jié)果應(yīng)通過免疫擴散試驗進行確認。一種新開發(fā)的橫向流動分析顯示靈敏度較低（31%）。球蟲補體結(jié)合（CF）試驗用于定量檢測免疫球蛋白G在血清和腦脊液樣本中具有預(yù)后效用（表5）。連續(xù)血清樣本與患者癥狀相關(guān)，有助于監(jiān)測治療過程。必須認識到球孢子菌病感染類型的差異及其在血清學動力學中對確定治療反應(yīng)的影響，因為與原發(fā)性肺球孢子菌病相比，慢性肺球孢子菌病或播散性球孢子菌病患者的血清學下降較慢。

球孢子菌性腦膜炎患者CSF的連續(xù)血清學檢測顯示與其他CSF指標相關(guān)，包括細胞計數(shù)、蛋白質(zhì)和葡萄糖；然而，血清學和常規(guī)腦脊液參數(shù)的反應(yīng)比疾病的臨床癥狀和體征慢，臨床決策應(yīng)基于癥狀、腦脊液參數(shù)和血清學結(jié)果。

建立了一種實時PCR檢測下呼吸道標本中球孢子菌的方法。球孢子菌抗原檢測也可以在市場上買到，對于血清陰性的免疫功能高度低下的患者可能有用。BDG對球孢子菌病的敏感性為44% ，特異性為91%。由于缺乏支持這種方法的數(shù)據(jù)，血清、尿液或腦脊液的系列抗原和BDG檢測沒有常規(guī)進行。

球孢子菌病替代生物標志物的總結(jié)和建議

血清學檢測有助于球孢子菌病的診斷，EIA結(jié)果應(yīng)通過免疫擴散得到證實。使用CF血清學進行縱向評估有助于監(jiān)測抗真菌治療的反應(yīng)。然而，關(guān)于其作為臨床試驗中使用的替代終點的效用的數(shù)據(jù)不足。

歷史上，組織胞漿菌病的第一個預(yù)后標志是接受抗真菌治療的HIV患者血培養(yǎng)陽性的持續(xù)時間。在艾滋病早期進行的研究中，疾病復(fù)發(fā)與陽性或持續(xù)陽性血培養(yǎng)有關(guān)。血液培養(yǎng)在HIV陰性患者中很少呈陽性，并且呈陽性的時間（平均>2周）限制了其在臨床實踐中治療患者或進行臨床試驗期間的適用性。

組織胞漿菌病診斷最廣泛使用的替代標記物是組織胞漿菌多糖半乳甘露聚糖抗原，可在尿液或血清中檢測到（圖3）。MiraVista（美國印第安納波利斯）和IMMY（美國俄勒岡州諾曼）等開發(fā)了組織胞漿抗原檢測。只有1項研究對391份HIV感染者尿液樣本（n=104份經(jīng)證實的播散性組織胞漿菌?。┻M行了MiraVista側(cè)流法和IMMY半乳甘露聚糖酶免疫法的比較；它報告了相似的敏感性（90%-91%）和特異性（91%-92%）（表5）。在成功的抗真菌治療過程中，組織胞漿抗原降低。在成功治療的HIV患者中，抗原血癥的下降速度比抗原尿更快，盡管在治療的前2周抗原下降失敗并不預(yù)示治療失敗。在臨床復(fù)發(fā)的患者中，86%的患者的縱向抗原水平顯著升高。

抗體檢測對患有慢性或亞急性肺組織胞漿菌病的非免疫抑制患者最有用，對于患有嚴重免疫抑制的患者可能為陰性（圖4）。如果懷疑較高，應(yīng)在1-2個月內(nèi)重復(fù)進行陰性檢測。雖然抗體在急性疾病后確實出現(xiàn)衰退，但沒有證據(jù)表明抗體滴度的變化或缺乏可以預(yù)測死亡率、治療成功率或復(fù)發(fā)。

組織胞漿菌病替代生物標志物的總結(jié)和建議

對HIV患者的尿液組織胞漿抗原進行了深入研究，有助于診斷、患者管理，并作為臨床試驗的潛在終點。在其他人群中，應(yīng)進行進一步研究，以確定縱向抗原檢測對判斷預(yù)后的有效性。

圖3.標本類型對組織胞漿菌病抗原的診斷重疊。數(shù)據(jù)來自113例病例，包括56例播散性組織胞漿菌病，32例急性肺組織胞漿菌病，1例亞急性肺組織胞漿菌病，6例慢性肺組織胞漿菌病，1例肉芽腫性縱隔炎，15例未知，5例未檢出。在播散性組織胞漿菌病和/或免疫功能低下的宿主中，抗原敏感性高于急性肺組織胞漿菌病或免疫正常宿主。

血清學檢測常用于副球孢子菌病的診斷，具有高度特異性（>95%）和敏感性（~80%）。已經(jīng)研究了許多方法，包括內(nèi)部分析，盡管現(xiàn)在可以進行商業(yè)免疫擴散試驗。先前的一項研究發(fā)現(xiàn)縱向血清學評估有助于監(jiān)測治療反應(yīng)。對43例急性或慢性副球孢子菌樣真菌病患者的分析發(fā)現(xiàn)，在2年的隨訪期內(nèi)，使用反向免疫電泳、補體固定或酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測抗體水平下降，與患者臨床癥狀改善一致?？贵w清除僅發(fā)生在隨訪超過12個月的單部位疾病患者中。復(fù)發(fā)性疾病患者的血清滴度水平升高，表明了連續(xù)監(jiān)測的效用。然而，在某些情況下，抗真菌治療開始后，血清學抗體滴度可能會增加，從而使血清學作為實用替代標記物的使用變得復(fù)雜。

抗原檢測也已作為副球孢子菌病診斷的輔助手段（表5）。在23例隨訪8-12個月的患者中，伊曲康唑治療期間抗原降低，治療12個月后所有患者均未檢測到抗原。不幸的是，這個測試不是商業(yè)上可用的。

副球孢子菌病中替代生物標志物的總結(jié)和建議

血清學檢測可用于副球孢子菌病的診斷，可用于監(jiān)測對抗真菌治療的反應(yīng)。然而，關(guān)于血清學作為用于臨床試驗的替代終點的數(shù)據(jù)不足。

血清學檢測不常用于孢子絲菌病的診斷，盡管有商業(yè)分析方法。過去評估乳膠凝集測定以幫助診斷腦膜孢子絲菌病；但是，該測定法不再適用，血清學檢測通常對其他形式的孢子絲菌病一般沒有幫助。已經(jīng)研究了更新的測定法并且表現(xiàn)出合理的靈敏度和特異性，但是受到可用性的限制。血清學用于評估對抗真菌治療反應(yīng)的效用與臨床反應(yīng)有不同的相關(guān)性，該測試不是常規(guī)推薦的或可商購的。

孢子絲菌病中替代生物標志物的總結(jié)和建議

目前正在開發(fā)幾種可能為孢子絲菌病診斷提供前景的檢測方法，并且在驗證后的未來臨床試驗中它們可能是有用的生物標志物。目前，沒有生物標志物可用作臨床試驗的替代終點。 

由于潛伏期長（3-14天）和感染早期的低產(chǎn)量（表5），目前基于培養(yǎng)的籃狀菌病診斷并不理想。在血液中進行的幾種實時PCR測定在小型臨床研究中顯示出有希望的診斷性能。針對馬爾尼菲籃狀菌特異性細胞壁甘露糖蛋白Mp1p的抗原檢測EIA與血培養(yǎng)相比具有高度敏感性（86%）和特異性（98%）（分別為73%和86%）。商業(yè)Mp1p EIA獲得批準中國于2019年，IMMY（諾曼，俄克拉荷馬州，美國）正在開發(fā)Mp1p LFA。

歷史上評估籃狀菌病的治療反應(yīng)一直基于解決發(fā)熱、皮膚損傷和/或真菌血癥緩解的綜合臨床和微生物學終點。在抗真菌治療中，Mp1p濃度已顯示在12至16周內(nèi)下降至無法檢測的水平（Thuy Le，未發(fā)表），Mp1p在治療監(jiān)測和預(yù)后中的作用是一項積極的研究課題。

最近開發(fā)了一種新的簡單的真菌培養(yǎng)技術(shù)，用于連續(xù)定量血液中的馬爾尼菲籃狀菌菌落數(shù)，以測量早期殺真菌活性（EFA）。EFA量化了前14天血液CFU/mL/天的減少。在伊曲康唑與兩性霉素B治療狼瘡的多中心試驗中，兩性霉素B組的EFA下降速度比伊曲康唑組快4倍，相當于24周死亡率從21.0%降至11.3%（P=0.006）。基線真菌菌落數(shù)是24周死亡率的獨立預(yù)測因子。這些數(shù)據(jù)表明，血液中的EFA是死亡率的有力替代指標，并且是評估治療反應(yīng)的有用終點。

籃狀菌病替代生物標志物的總結(jié)和建議

培養(yǎng)仍然是籃狀菌病的主要診斷方法?？乖瓩z測可能在驗證后的未來臨床試驗中有用，但目前不能推薦作為臨床試驗的替代終點。在最近的一項臨床試驗中，定量血液菌落數(shù)的縱向變化被發(fā)現(xiàn)對定量EFA有用，并應(yīng)成為未來臨床試驗的標準指標。