Bassetti等發(fā)文預(yù)測，至2050年，抗生素耐藥每年將造成世界上約1000萬人死亡，高于惡性腫瘤致死人數(shù)[1]，而下呼吸道感染的耐藥性對抗生素耐藥性的影響最大[2]。我國是抗生素使用大國，據(jù)統(tǒng)計僅2013年我國一年的抗生素使用量高達16.2萬噸，約占世界用量的一半，其中約48%為人用[3]。大量抗生素使用的原因之一在于感染性疾病病原學(xué)診斷困難，62%的社區(qū)獲得性肺炎難以獲得病原學(xué)依據(jù)[4]，只能經(jīng)驗性使用抗生素治療，這造成了一定程度上的抗生素濫用。近年來，學(xué)界一直在探討如何精準(zhǔn)獲得呼吸感染性疾病的病原學(xué)依據(jù)，并基于病原學(xué)依據(jù)規(guī)范使用抗生素，實現(xiàn)抗生素濫用及抗生素耐藥的雙降低，最終邁進呼吸感染性疾病的精準(zhǔn)診療時代[5]。目前宏基因組高通量測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于感染性疾病的病原學(xué)臨床診斷[6-7]，我國也發(fā)表了多篇專家共識指導(dǎo)mNGS技術(shù)在臨床上的規(guī)范應(yīng)用[8-14]，呼吸感染領(lǐng)域甚至在2018年，就已經(jīng)將mNGS技術(shù)寫進了相關(guān)指南以指導(dǎo)呼吸感染臨床實踐[15]，隨著近年來mNGS在呼吸感染領(lǐng)域中更加廣泛的應(yīng)用，mNGS技術(shù)是否能夠引領(lǐng)呼吸感染性疾病邁進精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代？呼吸領(lǐng)域?qū)I(yè)醫(yī)生觀點不一，本文就此談一談我們的看法。

mNGS技術(shù)是通過對臨床樣本的所有DNA或RNA進行鳥槍法測序，可以無偏倚地同時檢測多種病原微生物（包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲）。二代和三代測序平臺均可用于該項技術(shù)。按從樣本中提取的核酸類型不同可以分為宏基因組測序和宏轉(zhuǎn)錄組測序。按照測序模式可以分為單端測序和雙端測序[12]。隨著技術(shù)的逐步推廣，目前已逐漸實現(xiàn)臨床樣本不出「醫(yī)院」或者不出「本地區(qū)」的本地化檢測模式。

1、mNGS在呼吸系統(tǒng)細菌感染中的臨床實踐

呼吸系統(tǒng)細菌感染的主要病原體主要包括需氧菌，兼性厭氧菌及厭氧菌，此外還包括非典型病原體及結(jié)核分支桿菌及非結(jié)核分支桿菌等特殊類型[16]。對于肺部感染患者，mNGS的病原檢測陽性檢出率顯著優(yōu)于常規(guī)病原菌診斷方法（115/140，82.14%比50/140，35.71%，P<0.05)[17]。最近我國發(fā)起的一項全國多中心前瞻性臨床研究也進一步證實，mNGS對于重癥社區(qū)獲得性肺炎病原檢出率為90.3%，而傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)的病原檢出率僅有39.5%[18]。此外，mNGS對于肺部厭氧菌相關(guān)感染也有很好的診斷效率[19]，顯著彌補了傳統(tǒng)微生物檢測對于肺部厭氧菌感染診療的不足。研究顯示，肺部厭氧菌感染的標(biāo)本中mNGS病原檢出率為71.43%（10/14），遠高于培養(yǎng)7.14%（1/14）（P<0.01）[20]。此外，mNGS檢測還進一步明確了以前認(rèn)識非常不足的肺部感染病原微生物，比如微小微單胞菌肺部感染[21]。對于非典型病原體感染，例如鸚鵡熱衣原體，近兩年，這種以前少見的重癥肺炎致病病原體因mNGS技術(shù)的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)的越來越多，臨床醫(yī)生對此類病原體的認(rèn)識也越來越深入[22-24]。一項回顧性研究證實mNGS診斷肺結(jié)核的敏感性為59%（59/100），顯著高于涂片法（15%，15/100）和培養(yǎng)法（26%，26/100），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.001），但與Xpert法（52%，52/100）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.090）[25]；國內(nèi)多項相關(guān)研究也得出了類似的相似結(jié)論，但是mNGS在明確結(jié)核合并其他感染時具有獨特優(yōu)勢[26-27]。需要明確的是，在排除污染情況下，即使測到一條結(jié)核序列也要考慮其是致病菌可能性[11]。目前階段，對于肺結(jié)核診斷，可以通過mNGS聯(lián)合Xpert及傳統(tǒng)結(jié)核診斷方法提高診斷的敏感性。而需要強調(diào)的是測序深度對低豐度物種鑒定、對測序數(shù)據(jù)可信度均有影響[28]，且測序深度影響mNGS的敏感性[10, 12, 29]，或許提高測序深度能進一步調(diào)高mNGS對于肺結(jié)核的診斷敏感性，這需要進一步的研究證實。

2、mNGS在呼吸系統(tǒng)真菌感染中的臨床實踐

真菌是呼吸系統(tǒng)重要的感染病原之一[15-16]。最近的臨床實踐研究證實mNGS對于隱球菌、肺孢子菌、曲霉以及根霉等都有很好的診斷效率，可以提高重癥肺炎真菌病原學(xué)診斷的敏感性，可作為傳統(tǒng)真菌微生檢測手段的有效補充方法[30-32]，同時能夠明確少見真菌感染，如波氏假阿利什霉[33]。尤其是對于免疫力低下患者常繼發(fā)的肺孢子菌肺炎，mNGS不但敏感性高、特異性好，還可以檢出合并的其他病毒或細菌混合感染，并且發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液和血液樣本中mNGS檢測肺孢子菌結(jié)果高度一致[18, 31]。需要注意的是對于在核酸提取過程中破壁困難的真菌，主要包括曲霉、毛霉、隱球菌屬與雙相真菌等，即使在檢測報告中序列數(shù)較低，也要考慮其為致病微生物[12]。

3、mNGS在呼吸系統(tǒng)病毒感染中的臨床實踐

病毒作為呼吸系統(tǒng)感染的主要病原微生物之一[15-16]，近年來越發(fā)受到臨床重視，尤其是近年來新型冠狀病毒肺炎疫情的出現(xiàn)[34-35]。由于呼吸道樣本中病毒的核酸提取難度相對較簡單[12]，因此只要有合適的引物，理論上講mNGS對于呼吸系統(tǒng)病毒感染的診斷敏感性不優(yōu)于相應(yīng)的病毒PCR檢測[36]，而且如果是RNA病毒引起的相關(guān)感染，必須行mNGS RNA測序才能明確診斷，mNGS DNA檢測是不能識別RNA病毒相關(guān)感染的[12, 32]。mNGS對于呼吸系統(tǒng)病毒感染的優(yōu)勢主要在于新發(fā)未知病毒感染（如SARS-CoV-2[34]）及少見病毒感染診斷，例如最近報道的運用mNGS技術(shù)快速明確單純皰疹病毒性肺炎案例[37]，另外一項研究也證實了mNGS技術(shù)在重癥腺病毒７型肺炎快速精準(zhǔn)診斷中的重要作用[38]。

4、mNGS在呼吸系統(tǒng)混合病原體感染中的臨床實踐

最近中國疾病預(yù)防控制中心基于傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)的一項來自我國106個城市、277家哨點醫(yī)院和92個參考實驗室，歷時11年的呼吸道傳染病監(jiān)測數(shù)據(jù)明確了我國呼吸道感染的主要病原譜特征，其中混合感染不容忽視[39]。最近一項基于mNGS技術(shù)的研究也提示在納入的329例重癥社區(qū)獲得性肺炎患者中使用mNGS技術(shù)聯(lián)合常規(guī)微生物檢測方法進行病原體檢測，117例患者（35.9%）僅有1種潛在病原體，60例患者（18.2%）有2種潛在病原體，73例患者（22.2%）有3種潛在病原體，54例患者（16.41%）至少有4種潛在病原體[18]。因此，臨床醫(yī)生應(yīng)進一步提高對呼吸系統(tǒng)混合病原體感染的診療認(rèn)識。一項納入159例社區(qū)獲得性肺炎患者的隊列研究提示mNGS相對傳統(tǒng)檢測能夠明確更多的混合病原體感染[40]。尤其是對免疫抑制患者相關(guān)的呼吸系統(tǒng)感染，存在更多的混合病原體感染，mNGS技術(shù)體現(xiàn)出了其檢測范圍廣的獨特優(yōu)勢[18, 21, 41]。因此，在mNGS技術(shù)時代，如何根據(jù)mNGS檢測報告，結(jié)合傳統(tǒng)微生物檢測結(jié)果及患者臨床信息準(zhǔn)確識別并精準(zhǔn)確定真正的「責(zé)任」病原菌是實現(xiàn)呼吸道混合病原菌感染的關(guān)鍵[7, 11-12]。

1、缺乏統(tǒng)一規(guī)范的mNGS技術(shù)及報告解讀標(biāo)準(zhǔn)

mNGS技術(shù)目前已經(jīng)是一項成熟的技術(shù)，國內(nèi)也有數(shù)十家從事相關(guān)技術(shù)臨床應(yīng)用的公司及機構(gòu)，不同機構(gòu)mNGS技術(shù)具體實施細節(jié)也不盡相同，臨床醫(yī)生對于報告的臨床解讀也缺乏統(tǒng)一規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，存在基于個人臨床微生物經(jīng)驗性認(rèn)知的「經(jīng)驗性」解讀狀況。為進一步規(guī)范mNGS技術(shù)在臨床上的規(guī)范應(yīng)用，我國相關(guān)部門開展了全國多中心的mNGS試劑質(zhì)量評價聯(lián)合研究與mNGS室間質(zhì)量評價研究[42-43]，結(jié)果不容樂觀?，F(xiàn)階段制約mNGS臨床規(guī)范應(yīng)用的主要瓶頸，逐漸由技術(shù)本身的局限和挑戰(zhàn)轉(zhuǎn)變?yōu)橄嚓P(guān)試劑耗材及生物信息學(xué)分析的質(zhì)量控制與評價方法以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的缺失[44]。此外，不同室間對標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果存在差異，且假陽性和假陰性問題突出[42]。對于報告結(jié)果解讀，尤其是呼吸道感染相關(guān)檢測報告，缺乏臨床醫(yī)生及微生物相關(guān)專家的深度參與。相關(guān)研究也進一步提出并建議開展基于「本醫(yī)院」的本地化mNGS應(yīng)用模式，以規(guī)避并解決影響mNGS技術(shù)臨床規(guī)范應(yīng)用的相關(guān)因素[42, 45]。

2、mNGS技術(shù)在感染性疾病臨床實踐中的關(guān)鍵點

1）抗生素提前應(yīng)用對mNGS檢測結(jié)果的影響比傳統(tǒng)微生物檢測小

相關(guān)研究顯示在96例mNGS檢測前2周接受抗生素治療的患者中，血標(biāo)本的mNGS病原檢出率47.9%；血培養(yǎng)則只有19.6%[46]。主要原因是因為mNGS技術(shù)檢測的是微生物的核酸物質(zhì)，因此只要有微生物的核酸物質(zhì)存在，理論上講就能夠被檢測出來。

2）對于免疫力低下患者，糖皮質(zhì)激素使用量不影響mNGS病原檢出率

關(guān)于糖皮質(zhì)激素等對mNGS病原檢出率的影響，一項研究納入了108例接受糖皮質(zhì)激素治療的免疫抑制疑似感染的患者，結(jié)果提示，累計使用糖皮質(zhì)激素量大的免疫抑制患者中，mNGS病原檢出率不受糖皮質(zhì)激素藥量影響[47]。

3）mNGS技術(shù)指導(dǎo)臨床更改抗生素治療方案并改善呼吸系統(tǒng)感染患者預(yù)后

既往一項回顧研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)mNGS檢測結(jié)果，感染性疾病患者初始經(jīng)驗性抗生素治療未覆蓋可能致病菌的概率高達58.6%[48]。而在近年來的呼吸感染診療臨床實踐中，多數(shù)臨床醫(yī)生已經(jīng)開始根據(jù)mNGS檢測報告調(diào)整初始的經(jīng)驗性抗生素使用[18]，且根據(jù)mNGS檢測結(jié)果進行相關(guān)臨床用藥調(diào)整，能夠顯著提高呼吸系統(tǒng)感染患者的預(yù)后[49-51]。

4）血液mNGS檢測可替代難以獲得肺泡灌洗液樣本的重癥呼吸感染

一項納入20例重癥肺炎患者的研究顯示，同時送檢血液和肺泡灌洗液行mNGS檢測，肺泡灌洗液中的病原菌與血液樣本中的病原菌高度一致[52]。但是相關(guān)研究病例數(shù)少，還需要大樣本量的隊列研究進一步驗證相關(guān)結(jié)論。

5）實驗室環(huán)境、耗材、實驗操作及參考數(shù)據(jù)庫可能影響mNGS檢測結(jié)果

已有研究使用腦脊液樣本探討mNGS技術(shù)20 M數(shù)據(jù)量對不同的病原微生物檢出下限：巨細胞病毒（14拷貝數(shù)/mL），肺炎克雷伯菌（8 CFU/mL），人類免疫缺陷病毒（313拷貝數(shù)/mL），無乳鏈球菌（10 CFU/mL），黑曲霉菌（220 CFU/mL），新型隱球菌（0.2 CFU/mL），弓形蟲（81個/mL）[44, 53]?？梢?，mNGS對于樣本中的微生物檢測靈敏度之高，但這也帶來了另一個問題—「污染」，主要包括實驗耗材、環(huán)境（包括空氣環(huán)境）、實驗技術(shù)人員皮膚、實驗操作、甚至同批次強陽性樣本中微生物導(dǎo)致的污染[54]。因此，當(dāng)mNGS檢測結(jié)果陽性，而和臨床傳統(tǒng)檢測結(jié)果及臨床疑似感染病原菌不符，尤其是肺泡灌洗液樣本，除了要考慮上呼吸道微生物污染，也要考慮上述實驗環(huán)境及實驗操作相關(guān)微生物污染的可能性。此外，各個機構(gòu)所自有的mNGS微生物注釋參考數(shù)據(jù)庫不同，主要分為全基因組核酸序列數(shù)據(jù)庫、編碼蛋白的核酸序列數(shù)據(jù)庫和含有物種特征基因序列數(shù)據(jù)庫，基于全基因組核酸序列數(shù)據(jù)庫可能對比到的測序序列數(shù)最高，其他兩類數(shù)據(jù)庫對比到的測序序列數(shù)相對較少，但是特異性卻更高。因此，單純基于mNGS測序序列數(shù)設(shè)置閾值，再判斷所發(fā)現(xiàn)微生物是否具有致病性是不合時宜的[55]。綜上，對于mNGS技術(shù)臨床規(guī)范應(yīng)用，需要臨床醫(yī)生和檢測機構(gòu)實驗操作人員深入的實時溝通，這也凸顯了以「醫(yī)院」為主體，mNGS本地化檢測的優(yōu)勢[42]。

6）測序數(shù)據(jù)量、破壁及去宿主DNA實驗操作顯著影響mNGS檢測結(jié)果

測序深度對低豐度物種鑒定和測序數(shù)據(jù)可信度均有影響[28]，且測序深度影響mNGS的敏感性[10, 12, 29]，為避免假陰性，一般20 M數(shù)據(jù)量是較好的測序深度選擇[43]，而如果疑似致病菌量少，可選擇提高測序深度以提高陽性率。

細菌、真菌、病毒和寄生蟲的特性不同，增加破壁（例如使用玻璃珠研磨樣本）有利于提高難破壁細菌和真菌的核酸提取效率，但是可能損失病毒核酸[56]。因此，臨床醫(yī)生需要根據(jù)臨床疑似致病菌結(jié)合是否行破壁操作，綜合判斷mNGS報告的臨床符合率[11-12]。

目前去除宿主DNA的方法主要包括去污劑處理（皂苷）、低滲溶液破壞宿主細胞及抗甲基化DNA磁珠等[11]，目前所有的去宿主DNA操作均可能導(dǎo)致樣本中微生物數(shù)的絕對損失，尤其是對樣本中病毒、革蘭陰性菌及可能致病的少量微生物影響較大，導(dǎo)致假陰性結(jié)果[43]。因此，目前技術(shù)條件下，為確保mNGS檢測結(jié)果陽性率，提高測序數(shù)據(jù)量相對來說優(yōu)于去宿主DNA操作[11-12, 14]。

7）依據(jù)呼吸道樣本mNGS檢測結(jié)果中的抗生素耐藥基因指導(dǎo)臨床抗生素使用任重道遠

相關(guān)專家共識目前不建議使用mNGS技術(shù)檢測呼吸道樣本中微生物的耐藥性[12]。目前mNGS檢測細菌、真菌耐藥性基因存在較高的假陽性和假陰性，基因型和表型可能不一致，尤其對于呼吸道樣本，微生物種類多樣，而且目前大部分的mNGS都是以二代測序的短片度測序為主，組裝后明確的耐藥基因不能確定來自具體的哪個菌種，耐藥基因的解釋存在較大難度[12, 43, 45]。

8）mNGS技術(shù)的規(guī)范化應(yīng)用需要檢測人員和臨床醫(yī)生形成討論集體

mNGS技術(shù)是不同于傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)，涉及適宜患者選擇、規(guī)范樣本采集、復(fù)雜實驗室操作、生物信息學(xué)分析及報告規(guī)范解讀，需要檢測人員與臨床醫(yī)生形成實時討論集體，實現(xiàn)mNGS技術(shù)的規(guī)范化臨床應(yīng)用[45, 57]。

mNGS技術(shù)三代測序平臺納米孔測序近年來飛速發(fā)展，牛津納米孔技術(shù)（Oxford Nanopore Technologies，ONT）測序的準(zhǔn)確性已經(jīng)從最早的64%增加至如今的95%，目前的測序長度也可以達到50 kb，隨著已有的及新的微生物參考基因組序列完善，更高的測序準(zhǔn)確性（>99%）、更長的測序長度，以及測序所需的DNA和RNA樣品量進一步降低[58]，納米孔測序技術(shù)將實現(xiàn)呼吸系統(tǒng)感染性疾病8小時以內(nèi)的床旁快速診斷[59]。目前納米孔測序技術(shù)在耐藥基因的檢測應(yīng)用上還主要集中在單菌檢測上[60-61]，未來隨著技術(shù)的進步，對于呼吸道復(fù)雜微生物樣本，基于長片段的納米孔測序技術(shù)將來自不同細菌基因組的抗生素耐藥基因彼此分開，以進行后續(xù)分析及臨床應(yīng)用。

mNGS技術(shù)目前已引領(lǐng)呼吸系統(tǒng)感染性疾病邁向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代，但是其臨床應(yīng)用還存在眾多不足，迫切需要各個機構(gòu)推動基于「本醫(yī)院」的本地化mNGS技術(shù)臨床應(yīng)用模式，從而解決mNGS技術(shù)臨床規(guī)范應(yīng)用難題，真正讓mNGS這個「明天的技術(shù)」解決今天呼吸系統(tǒng)感染的快速、精準(zhǔn)、規(guī)范診療難題。

利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。

參考文獻略。