《超多重PCR技術(shù)及其在臨床病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用》

1.1 PCR及多重PCR技術(shù)

1.1.1 PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導(dǎo)未知片段中微量待測(cè)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。PCR反應(yīng)體系主要包括待擴(kuò)增樣品模版、特異性引物、DNA聚合酶(polymerase)、擴(kuò)增底物dNTPs以及含有Mg2+的反應(yīng)緩沖液幾部分，通過(guò)高溫變性（DNA解聚為單鏈）、退火（特異性引物結(jié)合與模板）、延伸（在DNA聚合酶作用下從5’向3’端進(jìn)行模板互補(bǔ)配對(duì)延伸）等步驟，對(duì)模板上引物范圍內(nèi)的DNA片段實(shí)現(xiàn)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。PCR技術(shù)于1985年發(fā)明，由于該技術(shù)對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立起到至關(guān)重要的作用，發(fā)明人穆勒獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。由于PCR技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得大量DNA片段，靈敏度高、特異性強(qiáng)，因而廣泛應(yīng)用于病原微生物、遺傳病相關(guān)基因、腫瘤相關(guān)基因、優(yōu)生優(yōu)育等領(lǐng)域的檢測(cè)。

圖1.PCR流程示意圖（來(lái)源：中國(guó)儀器網(wǎng)）

1.1.2 多重PCR技術(shù)

PCR產(chǎn)生以來(lái)，以常規(guī) PCR 為基礎(chǔ)衍生出一系列新的 PCR 檢測(cè)技術(shù)。多重PCR(multiplex PCR, mPCR)顧名思義，是在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行兩種及以上PCR片段特異性擴(kuò)增的技術(shù)，由Chambehian于1988年提出，其反應(yīng)原理、操作過(guò)程及儀器均與常規(guī)PCR相同，優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)不同的模板實(shí)現(xiàn)一次性同時(shí)擴(kuò)增，檢測(cè)通量有所提升，同時(shí)在引入定量?jī)?nèi)參的情況下，還可指征模板的數(shù)量情況。

對(duì)于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析的傳統(tǒng)方式有限制性內(nèi)切酶消化鑒定、基于電泳的方法，包括瓊脂糖凝膠電泳、微流控毛細(xì)管電泳、聚丙酰胺凝膠電泳等。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，由于DNA片段整體帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下會(huì)在電泳儀內(nèi)向正極遷移，遷移速率受PCR擴(kuò)增片段大小的影響。故可將大小不同的PCR產(chǎn)物在電泳過(guò)程中分開(kāi)。該方法快速且成本較低，但由于通過(guò)片段大小判斷PCR過(guò)程中是否發(fā)生特異性擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)在考慮特異性的同時(shí)，不同擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度差異需高于電泳的分辨率。因此這一檢測(cè)手段的分辨率從源頭上限制了多重PCR中可以最大同步擴(kuò)增的產(chǎn)物數(shù)量。

伴隨著測(cè)序技術(shù)，尤其是NGS技術(shù)的發(fā)展，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行高靈敏度及高分辨率的檢測(cè)成為了可能，因此多重PCR可同步擴(kuò)增的片段數(shù)量上限演變?yōu)槎嘀豍CR自身體系的限制。不同于傳統(tǒng)僅僅進(jìn)行4-5重，至多30重的PCR反應(yīng)體系，上千重甚至上萬(wàn)重的超多重PCR(high-multiplex PCR或ultrahigh-multiplex PCR)的實(shí)現(xiàn)輔以NGS測(cè)序，形成的靶向-NGS（tNGS）技術(shù)已逐漸在遺傳病診斷、腫瘤基因檢測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮作用。

1.2 超多重PCR技術(shù)要點(diǎn)簡(jiǎn)介

超多重PCR的難點(diǎn)在于，若想在一個(gè)體系中實(shí)現(xiàn)上百、上千甚至上萬(wàn)個(gè)片段的特異性擴(kuò)增，并非簡(jiǎn)單將引物混合擴(kuò)增即可。不同引物的特異性、不同擴(kuò)增片段本身的特異性及擴(kuò)增條件均為需要綜合考慮的內(nèi)容。設(shè)計(jì)超多重PCR時(shí)，至少需要綜合考慮以下幾點(diǎn)因素：

1.  目的基因片段的選擇：需要擴(kuò)增的目的基因片段需要具有足夠的特異性，否則容易在退火階段出現(xiàn)不同基因片段之間的非特異性配對(duì)，導(dǎo)致PCR效率降低。

2.  引物設(shè)計(jì)：特異性，即多對(duì)引物之間不能互補(bǔ)，尤其需要避免3’端互補(bǔ)；長(zhǎng)度，引物需要具有一定的長(zhǎng)度實(shí)現(xiàn)其特異性，但較長(zhǎng)的引物會(huì)更容易引起引物二聚體形成，降低引物有效濃度；退火溫度，引物Tm值需要相對(duì)高一些以提高退火溫度，在后續(xù)mPCR中選用最低退火溫度以增加擴(kuò)增特異性。

3.  反應(yīng)體系：反應(yīng)體系中各組分需滿足每隊(duì)引物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)擴(kuò)增量的需求。比如dNTP能夠結(jié)合Mg2+,但DNA聚合酶發(fā)揮活性有賴于游離的Mg2+，因此dNTP和Mg2+的濃度需要有所平衡;DNA聚合酶含量過(guò)低造成擴(kuò)增產(chǎn)物的降低，含量過(guò)高容易導(dǎo)致不同濃度模板的不均勻擴(kuò)增以及背景擴(kuò)增升高等問(wèn)題。

由此可見(jiàn)，超多重PCR希望實(shí)現(xiàn)較好的擴(kuò)增性能，需要綜合考慮反應(yīng)多方條件，具有極高的技術(shù)壁壘，目前全球真正掌握該技術(shù)的公司數(shù)量屈指可數(shù)。

1.3 靶向-NGS（tNGS）技術(shù)的應(yīng)用

超多重PCR兼具PCR對(duì)于特定微量DNA模板的特異性擴(kuò)增性能以及多個(gè)片段同步擴(kuò)增的能力，配合NGS測(cè)序，會(huì)擁有比普通宏基因組，全外顯子組測(cè)序更為靈敏的特定基因檢出率，此外前期建庫(kù)流程更加簡(jiǎn)便易行并具有相當(dāng)大的成本優(yōu)勢(shì)。目前tNGS技術(shù)的應(yīng)用范圍至少包括遺傳疾病檢測(cè)、癌癥檢測(cè)、人類身份鑒定和傳染病檢測(cè)等幾個(gè)方面。

圖2. 超多重PCR-NGS技術(shù)應(yīng)用范圍（來(lái)源：Thermo Fisher官網(wǎng)）

1.3.1 遺傳疾病研究及相關(guān)檢測(cè)

在輔助生殖領(lǐng)域，胚胎植入前基因篩查（PGS）可以幫助提高懷孕成功率。這一檢查需要在胚胎發(fā)育的第2天或第5天檢查是否發(fā)生基因組異倍體性，由于此階段可用于檢測(cè)的胚胎細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量極少，用超多重PCR的方式進(jìn)行全基因組規(guī)模的擴(kuò)增會(huì)大大增加檢測(cè)的敏感性和特異性。將tNGS用于新生兒進(jìn)行相關(guān)檢查、遺傳病及攜帶者篩查的最大優(yōu)勢(shì)在于一次檢出通量大于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，同時(shí)相比于外顯子組測(cè)序具有更低的價(jià)格。

在科學(xué)研究領(lǐng)域，tNGS方法同樣具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。2015年，協(xié)和醫(yī)院發(fā)表文章利用超多重PCR-NGS技術(shù)研究限制性心心肌?。╮estricted cardiomyopathy, RCM）中MYBPC3基因突變與遺傳性心臟病表型之間的相關(guān)性。研究人員選擇具有家族世代關(guān)系的3位RCM患者以及1位零散發(fā)生RCM的不相關(guān)患者進(jìn)行了原發(fā)性心肌病相關(guān)64個(gè)候選致病基因的超多重PCR，并利用NGS確認(rèn)了3位家族性RCM成年患者攜帶相同的MYBPC3的無(wú)義突變（基因翻譯提前終止導(dǎo)致無(wú)法生成功能性蛋白），不相關(guān)的RCM患者攜帶MYBP3的錯(cuò)義突變，并且該結(jié)果被測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法所證實(shí)。

1.3.2 癌癥基因檢測(cè)

除了對(duì)多種靶向藥基因突變進(jìn)行同時(shí)鑒定以指導(dǎo)用藥之外，超多重PCR對(duì)于微量DNA信號(hào)的特異性放大能力在cfDNA檢測(cè)及血液腫瘤治療后微小殘留病（MRD）的鑒定等領(lǐng)域都具有極大的優(yōu)勢(shì)。

在2019年發(fā)表的一項(xiàng)研究中，UCSF Benioff兒童醫(yī)院的研究人員利用超多重PCR技術(shù)對(duì)青少年慢性骨髓單核細(xì)胞性白血?。↗MML）的造血干細(xì)胞移植前（pre-HCT）化療是否影響疾病的分子負(fù)擔(dān)以及對(duì)造血干細(xì)胞移植后（post-HCT）效果的影響進(jìn)行了研究。針對(duì)21位JMML患者，研究人員通過(guò)tNGS分別對(duì)pre-HCT化療前后驅(qū)動(dòng)基因突變的頻率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)pre-HCT化療造成分子響應(yīng)和無(wú)響應(yīng)的患者其造血干細(xì)胞移植后五年無(wú)進(jìn)展生存率分別為100%和61%，顯示了利用tNGS進(jìn)行HCT預(yù)后評(píng)估的潛在能力。

圖3. 經(jīng)tNGS驗(yàn)證對(duì)于化療響應(yīng)的患者具有更高的預(yù)后（來(lái)源：Pediatr Blood Cancer）

1.3.3 病原微生物檢測(cè)

由于臨床上對(duì)于常見(jiàn)致病微生物的種類已有相對(duì)明確的認(rèn)知（~1000種），因此，針對(duì)病原微生物設(shè)計(jì)tNGS體系，以實(shí)現(xiàn)臨床感染樣本，尤其是復(fù)雜感染樣本內(nèi)各類病原體的靈敏性檢出，是解決目前臨床病原體診斷領(lǐng)域諸多問(wèn)題的一種非常有效的手段。但針對(duì)病原微生物檢測(cè)的超多重PCR體系相比于人類遺傳病基因檢測(cè)或癌癥基因檢測(cè)，需要在更小的基因組范圍內(nèi)考量上百甚至上千個(gè)不同種屬間基因片段的特異性擴(kuò)增，體系設(shè)計(jì)難度更大，故在這一領(lǐng)域還未出現(xiàn)絕對(duì)的龍頭企業(yè)。但tNGS法可以優(yōu)秀的性能及可接受的成本彌補(bǔ)現(xiàn)今臨床多種病原檢測(cè)方案的諸多缺點(diǎn)，應(yīng)用前景值得期待。關(guān)于臨床病原體檢測(cè)及tNGS在其中的應(yīng)用將在下文進(jìn)一步介紹。

2.1 感染性疾病概述

感染性疾病是臨床常見(jiàn)的多發(fā)病，是全球死亡率和發(fā)病率最高的疾病之一。廣義的感染性疾病包括所有病原微生物感染引起的疾病。這些病原體以病毒和細(xì)菌為代表，主要包括立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊病毒、寄生蟲(chóng)等物質(zhì)。感染性疾病廣泛存在于臨床各個(gè)科室中，如ICU，外科、心血管科、神經(jīng)科、呼吸科、血液科、泌尿科、內(nèi)分泌科、生殖科等，一直以來(lái)都是人類健康的重要威脅。

病原微生物的診療已成為臨床醫(yī)生及感染控制工作者共同關(guān)注的焦點(diǎn)，主要包括及時(shí)正確地進(jìn)行感染源的診斷以及從抗菌譜與抗菌作用、藥理特性和不良反應(yīng)等方面選擇合適的抗菌藥物兩方面。病原微生物檢測(cè)可以從病原體種類、藥敏以及毒力等因素評(píng)估感染情況，從而為感染性疾病的治療及預(yù)防提供重要參考和關(guān)鍵依據(jù)。

2.2 病原微生物檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介

病原微生物檢測(cè)通常是對(duì)病人感染部位取樣檢查，判斷菌種。常用微生物檢查標(biāo)本有血液、尿、痰、胸水、腹水、各種分泌物、各種穿刺液、灌洗液以及鼻咽/口咽拭子等。隨著醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，病原微生物診斷已由傳統(tǒng)染色、培養(yǎng)等宏觀手段發(fā)展到以DNA、RNA和蛋白為對(duì)象的分子生物技術(shù)檢測(cè)方式。

2.2.1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

傳統(tǒng)病原微生物的檢測(cè)包括形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)以及免疫學(xué)方法三類。其中形態(tài)學(xué)檢查以及免疫學(xué)方法不需要進(jìn)行病原體的分離培養(yǎng)。傳統(tǒng)檢測(cè)方法通過(guò)觀察病原體本身的形態(tài)特征、測(cè)定代謝物、測(cè)定生化反應(yīng)及檢測(cè)病原體的抗原或抗體等手段，對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，測(cè)試其藥敏特征。在一般診療過(guò)程中，形態(tài)學(xué)檢查僅可用于初步判斷病原體大類，免疫學(xué)方法的檢測(cè)通量較低，而培養(yǎng)法是目前病原體檢測(cè)中的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有耗時(shí)較長(zhǎng)，過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高等缺點(diǎn)。

2.2.1.1形態(tài)學(xué)檢查：涂片鏡檢

涂片精檢是一種將待檢樣品取材、制片后在顯微鏡下觀察、分析和判斷樣品中微生物種類的一種臨床診斷方法，通常用于疾病的初步判斷。人體的排泄物、分泌物或病患組織都可以作為檢查對(duì)象。常見(jiàn)的涂片鏡檢有革蘭氏染色法，可檢出革蘭氏陽(yáng)性菌（如肺炎雙球菌、炭疽桿菌）、陰性菌（如百日咳桿菌、痢疾桿菌）。經(jīng)過(guò)包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等步驟后，革蘭氏陽(yáng)性菌呈現(xiàn)紫色，革蘭氏陰性菌呈現(xiàn)紅色并且由于染色使得細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征更易于觀察，從而更利于分類鑒定。此外還有抗酸染色、芽孢染色、鞭毛染色等多種染色方式。通過(guò)染色或直接觀察，可根據(jù)菌體形態(tài)大致分為球菌（分散狀、成堆狀、鏈狀、成雙狀），桿菌（長(zhǎng)桿菌、短桿菌、鏈桿菌、彎曲桿菌等），弧菌等類型。

2.2.1.2免疫學(xué)檢查

免疫學(xué)檢測(cè)是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)原理的檢測(cè)方法， 將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測(cè)試技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來(lái), 利用超微量的檢測(cè)形式, 實(shí)現(xiàn)病原的鑒定。既可以檢測(cè)病原菌的抗原，也可以檢測(cè)免疫細(xì)胞的抗體?？乖瓩z測(cè)可以確認(rèn)病原菌，而抗體檢測(cè)則是預(yù)防檢測(cè)，健康評(píng)估的方法，兩者相輔相成。臨床上CRP檢測(cè)即屬于免疫檢測(cè)的一種。免疫檢測(cè)的靈敏度和特異性高，比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法耗時(shí)減少。但病原體種類繁多，已研發(fā)的抗原、抗體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，且檢測(cè)結(jié)果很大程度上依賴于抗體的好壞，抗體制備、檢測(cè)操作過(guò)程較繁瑣，且抗體易受環(huán)境中各種物質(zhì)和微生物的干擾，影響了它的廣泛應(yīng)用，測(cè)定成本較高。

2.2.1.3 培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是指根據(jù)盲樣檢測(cè)目標(biāo)、盲樣性狀以及染色鏡檢等信息，選擇分離培養(yǎng)用培養(yǎng)基及增菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基對(duì)樣本中的病原微生物進(jìn)一步擴(kuò)增及分離培養(yǎng)，用以后續(xù)生化檢測(cè)、鑒定病原體精確類型的方法。其具體步驟包括微生物培養(yǎng)及生化或其他類型的檢測(cè)兩部分。例如使用羅氏培養(yǎng)法診斷肺結(jié)核病。羅氏培養(yǎng)基可促進(jìn)分枝桿菌的生長(zhǎng)并抑制其他雜菌，經(jīng)培養(yǎng)3-4周后分枝桿菌形成菌落，呈干燥顆粒狀，乳白色或米黃色，形似花菜心。目前臨床診斷上仍主要依賴于培養(yǎng)結(jié)果，但培養(yǎng)病原體過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)至少48～72小時(shí)，可能滯后于治療。同時(shí)臨床上常規(guī)僅能對(duì)部分細(xì)菌進(jìn)行穩(wěn)定培養(yǎng)，大多數(shù)病原微生物如肺炎鏈球菌等難以培養(yǎng)，真菌和病毒的培養(yǎng)往往很少使用，因此培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率不高。此外采樣或送檢過(guò)程中引入的外界污染有可能在培養(yǎng)過(guò)程中被進(jìn)一步放大，出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象。

通過(guò)培養(yǎng)獲得濃度及純度相對(duì)較高的病原微生物之后，生化方法通過(guò)檢測(cè)微生物表達(dá)的特異性酶，對(duì)微生物種類進(jìn)行鑒定。使用特定的底物，檢測(cè)微生物代謝底物的能力，即可判斷微生物是否具有某種特定的酶。例如檢測(cè)沙門氏菌的辛酯酶法。各屬腸桿菌科細(xì)菌中只有沙門氏菌表達(dá)辛酯酶，根據(jù)這一特性，甄宏太等開(kāi)發(fā)了快速檢測(cè)沙門氏菌的辛酯酶法。該方法是以42甲基傘形酮辛酯（MUCAP）為底物，在沙門氏菌的酶促反應(yīng)后，生成4MU，在紫外燈下可觀察到藍(lán)色熒光。該方法在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成，適合病菌的初步篩查。

目前臨床上針對(duì)培養(yǎng)樣本的生化檢測(cè)，已有較高通量的自動(dòng)生化鑒定體系建立。全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)是一種集生化反應(yīng)、計(jì)算機(jī)和自動(dòng)化技術(shù)于一體的檢測(cè)技術(shù)，具有速度快，通量高的優(yōu)點(diǎn)。常見(jiàn)儀器如法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK系統(tǒng)和美國(guó)BD公司的PHOENIX系統(tǒng)。自動(dòng)化系統(tǒng)可進(jìn)行多達(dá)幾十種的微量生化反應(yīng)和藥敏生長(zhǎng)試驗(yàn)，根據(jù)各生化反應(yīng)孔中的生長(zhǎng)變化及呈色反應(yīng)情況，由計(jì)算機(jī)通過(guò)數(shù)值編碼技術(shù)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析，得到鑒定結(jié)果。

2.2.2 基于分子的病原體檢測(cè)技術(shù)

2.2.2.1蛋白檢測(cè)

目前針對(duì)病原體蛋白的直接檢測(cè)使用質(zhì)譜技術(shù)，基于已建立的微生物胞膜蛋白質(zhì)、脂多糖、核酸等的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)微生物進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定和分析。質(zhì)譜方法針對(duì)培養(yǎng)后濃度較高、品種較為單一的待測(cè)樣品，通過(guò)獲得其蛋白質(zhì)圖譜，再與已知微生物構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)的參考圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定病原微生物。質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)高效快速且成本低，加之其高靈敏度、高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，在臨床微生物檢測(cè)等方面獲得了廣泛的應(yīng)用，用于多類型樣本中細(xì)菌和真菌的直接鑒定。但目前僅能處理培養(yǎng)后菌株等相對(duì)單純樣品，難以對(duì)原始臨床標(biāo)本中復(fù)雜背景樣品進(jìn)行病原檢測(cè)，檢測(cè)內(nèi)容也僅限于病原體分型，在生物耐藥性分析和毒力研究等方面進(jìn)展較少。

2.2.2.2核酸檢測(cè)

基于核酸的檢測(cè)早期使用PCR的方式，對(duì)病原微生物基因組或轉(zhuǎn)錄組片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行鑒定或片段擴(kuò)增進(jìn)程進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)病原體的鑒定。

PCR技術(shù)的具體原理如上文所述，在病原微生物領(lǐng)域使用到的PCR衍生技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)（獲得RNA病毒的cDNA文庫(kù)并用以后續(xù)檢測(cè)）、半巢式和巢式聚合PCR (seminested PCR 和 nested PCR)、多重PCR（mPCR）以及多通道熒光定量PCR等。這些衍生技術(shù)有各自特點(diǎn)，能有效應(yīng)用于環(huán)境病原體檢測(cè)。如巢式PCR。巢式PCR是常規(guī)PCR的一種演變，其增強(qiáng)了反應(yīng)特異性和目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量。巢式PCR中設(shè)計(jì)有兩對(duì)引物：第一對(duì)（外引物）在目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的側(cè)翼，這一對(duì)PCR引物擴(kuò)增過(guò)程和普通PCR相似。而第二對(duì)引物（巢式引物）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，對(duì)應(yīng)于所擴(kuò)增DNA的準(zhǔn)確區(qū)域，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。

與普通PCR相比，巢式PCR 克服了單次擴(kuò)增平臺(tái)期效應(yīng)的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了PCR的敏感性。巢式引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二階段反應(yīng)能否進(jìn)行，也是對(duì)第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，因引可以保證整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性。對(duì)于是樣品中目的基因的表達(dá)豐度較低的情況下，巢式PCR的優(yōu)勢(shì)突顯。但相比傳統(tǒng)PCR，巢式PCR在進(jìn)行第二次擴(kuò)增時(shí)引起交叉污染的幾率較大。巢式PCR檢測(cè)目標(biāo)病原多為病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。

多重PCR的引入增加了病原體的檢測(cè)通量，但市面上的多重PCR擴(kuò)增大多基于細(xì)菌的16S或23S或真菌的18S。針對(duì)這一區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，不同種病原體的引物片段存在重疊，限制了多重PCR一次反應(yīng)能夠特異性擴(kuò)增的病原體數(shù)量，一般情況下很難實(shí)現(xiàn)超過(guò)30種特異性片段的同時(shí)擴(kuò)增。

PCR特異性擴(kuò)增后檢測(cè)是否存在特異性擴(kuò)增片段以實(shí)現(xiàn)病原體的鑒定方面，可用的方法除了上文提到的電泳法，還包括熱熔曲線法、基因芯片等方式。

熱熔曲線法是在正常的PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上加一個(gè)溶解曲線的反應(yīng)條件，溶解曲線分析可以用來(lái)確定不同的反應(yīng)產(chǎn)物，包括非特異性產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過(guò)逐漸增加溫度同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)來(lái)產(chǎn)生溶解曲線.其中當(dāng)溫度由60℃升至95℃時(shí)，PCR儀每隔一定的溫度檢測(cè)一次信號(hào)。最后將收集的信號(hào)繪制出溶解曲線。隨著反應(yīng)中雙鏈DNA變性，熒光染料又回復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號(hào)降低，用熒光信號(hào)改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)與溫度作圖，在擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度，與不同DNA片段的堿基組成相關(guān)），用這個(gè)特征峰就可以將特異產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開(kāi)，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓煌臏囟热芙狻Ｃ恳粭l線代表著某個(gè)孔里的反應(yīng)體系里產(chǎn)物的單一情況，某一條線如果為單峰且在一定合理的溫度范圍內(nèi)（一般為80~90℃）則認(rèn)為正常，如果為雙峰則可能有非特異性擴(kuò)增。由此可以判斷產(chǎn)物是否為目的基因且是否單一?？梢钥闯?，該方法實(shí)際上檢測(cè)的是不同擴(kuò)增片段DNA堿基所占比（GC比），因此僅能作為近似模擬，無(wú)法精準(zhǔn)保證擴(kuò)增片段一定是目的基因片段，對(duì)于病原體鑒定的精確度相對(duì)有限，同時(shí)穩(wěn)定性依然有待提高。

總的來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)的遍耗時(shí)較長(zhǎng)且存在一定的假陽(yáng)性率。多種因素影響標(biāo)本質(zhì)量，從而影響培養(yǎng)結(jié)果的準(zhǔn)確性，且絕大多數(shù)病原體不可培養(yǎng)。還有以PCR為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)在敏感性、特異性和檢測(cè)時(shí)效上明顯優(yōu)于培養(yǎng)法，但因?yàn)樵摲ɑ谝阎≡幕蛐蛄羞M(jìn)行定向檢測(cè)，在無(wú)法實(shí)現(xiàn)超多重PCR的前提下所能提供的信息有限，依然不能很有效地解決臨床診斷陽(yáng)性率低的問(wèn)題；除此之外，對(duì)于混合感染和未知致病微生物的檢測(cè)是傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法逾越的障礙。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過(guò)1/3的復(fù)雜感染性疾病患者因傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法確定病原體信息，不能得到及時(shí)有效地救治，從而使病情惡化。且如今疑難感染病例不斷增多，傳統(tǒng)診斷方法跟不上微生物進(jìn)化和變異的節(jié)奏，傳染病的傳播速度明顯加快，而臨床檢測(cè)方法的局限常常導(dǎo)致錯(cuò)誤用藥和延誤治療，故此盡快發(fā)展新的能滿足臨床需求的檢測(cè)方法刻不容緩。

表1.常規(guī)病原微生物檢測(cè)技術(shù)對(duì)比

數(shù)據(jù)來(lái)源：公開(kāi)資料整理，探針資本

2.2.3 基于NGS的新型檢測(cè)方式

如上所述，二代測(cè)序成本的進(jìn)一步下降導(dǎo)致了將NGS引入病原微生物檢測(cè)成為可能。相比于傳統(tǒng)檢測(cè)方式，NGS方法在檢測(cè)時(shí)間、通量以及準(zhǔn)確性上具備諸多優(yōu)勢(shì),因而針對(duì)重癥感染及ICU感染具有傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。

2.2.3.1 宏基因組測(cè)序（mNGS）簡(jiǎn)介

mNGS（metagenomics next-generation sequencing），也稱宏基因組二代測(cè)序技術(shù)，是一種不基于培養(yǎng), 借助二代測(cè)序平臺(tái)快速測(cè)序直接從環(huán)境/臨床樣品中提取全部微生物的核酸序列，進(jìn)一步與各個(gè)物種的基因組序列對(duì)比，從而得知樣品中微生物的種類和比例的高通量測(cè)序方法，可廣泛分析臨床樣本微生物組（細(xì)菌、真菌、病毒）。相比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，mNGS擁有更高敏感性以及更快的檢測(cè)速度，這與“精準(zhǔn)診療”的理念相契合，被認(rèn)為是臨床病原檢測(cè)的重大變革。目前該技術(shù)已經(jīng)納入的病原體有8000多種，其中包括3000余種細(xì)菌，4000余種病毒，200 余種真菌和140種寄生蟲(chóng)，為疑難危重癥及罕見(jiàn)病原微生物感染的診斷提供了有效的技術(shù)手段。

使用宏基因組二代測(cè)序技術(shù)（mNGS）檢測(cè)病原微生物通常需要采樣、提取核酸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序文科、高通量測(cè)序、生物信息分析和報(bào)告解讀6個(gè)步驟。

圖4. mNGS檢測(cè)步驟(來(lái)源：Nature Reviews 2019)

mNGS檢測(cè)方法首先將微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜打破，使基因組DNA釋放出來(lái)，然后根據(jù)DNA的特質(zhì)，將其從結(jié)合的蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。得到純化的宏基因組DNA后，通過(guò)微量提取及建庫(kù)方法，制備病原體核酸文庫(kù)，并對(duì)其核酸序列進(jìn)行高通量測(cè)序。mNGS的高通量測(cè)序方法先后有羅氏454焦磷酸測(cè)序技術(shù)、Illumina（Solexa測(cè)序技術(shù)）、SOLiD測(cè)序技術(shù)和Ion Torrent測(cè)序技術(shù)。目前市場(chǎng)上以Illumina（Solexa測(cè)序技術(shù)）為主，Ion Torrent測(cè)序技術(shù)為輔。高通量測(cè)序后將所得核酸序列與微生物專用數(shù)據(jù)庫(kù)中病原體標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行同源性或序列特征比對(duì)分析，從而得到鑒定結(jié)果。這種方法不依賴于細(xì)菌培養(yǎng)，從取樣，核酸提取及建庫(kù)到測(cè)序、生信分析及報(bào)告時(shí)間僅需約24小時(shí)，且可同時(shí)檢測(cè)理論上所有已完成基因組測(cè)序的病原體，具有十分強(qiáng)大的檢測(cè)性能。

mNGS 對(duì)膿毒癥、重癥肺部感染等嚴(yán)重感染具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，能快速、精準(zhǔn)地找到病原體并對(duì)抗菌藥物治療方案的制定和治療效果的評(píng)估有一定的指導(dǎo)作用。目前mNGS技術(shù)已逐步用于臨床疑難感染診斷，203年C.Y.Chiu 教授首次成功應(yīng)用mNGS技術(shù)為一位不明原因發(fā)熱的男孩確診為鉤端螺旋體腦炎。2014年中國(guó)協(xié)和醫(yī)院關(guān)鴻志教授用mNGS確診了人類皰疹病毒腦炎。2016年深圳第三醫(yī)院用mNGS技術(shù)確診了一例罕見(jiàn)阿米巴腦炎。2017年中國(guó)華山醫(yī)院張文宏教授應(yīng)用mNGS技術(shù)先后確診了跨物種傳播的狂犬病毒以及錐蟲(chóng)感染等，并給與針性治療使患者痊愈。這些成功案例無(wú)一不預(yù)示著mNGS技術(shù)在生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域上廣闊的發(fā)展前景。

盡管mNGS 用于臨床病原診斷具有諸多優(yōu)勢(shì)，但其技術(shù)仍然面臨著一些挑戰(zhàn)。例如，在測(cè)序中真正有意義的基因片段比例較低。采樣時(shí)樣本難以完全排除人源細(xì)胞，而人類基因組的大小（3Gb）遠(yuǎn)大于細(xì)菌的基因組（3Mb）。當(dāng)人源細(xì)胞和細(xì)菌數(shù)量為1：1時(shí)，測(cè)序信號(hào)中人源基因片段數(shù)量與細(xì)菌基因片段高達(dá)2000：1，這意味著目標(biāo)基因片段在整體樣本中的含量較低，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)成本整體偏高，并可能會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)基因片段太小而致使無(wú)法明確檢測(cè)病原種屬的可能。在臨床應(yīng)用上，mNGS技術(shù)還存在一些目前難以解決的問(wèn)題：

1. 難以mNGS技術(shù)檢出的病原體只能代表標(biāo)本中存在這些檢出微生物，無(wú)法具體確定是定植菌、背景菌還是致病菌。

2. mNGS技術(shù)對(duì)于胞內(nèi)菌、真菌兩類微生物檢測(cè)敏感性較低：由于測(cè)序成本的限制，mNGS需盡量排除人源細(xì)胞的干擾。因此針對(duì)胞內(nèi)感染菌如結(jié)核分枝桿菌、軍團(tuán)菌等，由于其在體液內(nèi)密度較低而導(dǎo)致檢測(cè)敏感性偏低；同時(shí)mNGS對(duì)于具有較厚細(xì)胞壁的病原體及真菌核酸提取效率較低，導(dǎo)致檢出率和敏感性較低。

3.  mNGS檢測(cè)技術(shù)對(duì)RNA病毒檢測(cè)難度大：RNA轉(zhuǎn)錄本身有更高的豐度和復(fù)雜度，又容易降解，對(duì)運(yùn)輸和保存的要求較高，因此RNA病毒的臨床檢測(cè)還存在一定的困難。

4. 在耐藥檢測(cè)上，目前使用 mNGS 進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)還存在一定的困難?，F(xiàn)有檢測(cè)方法因成本考慮導(dǎo)致耐藥相關(guān)基因覆蓋度較低，難以高靈敏度地檢測(cè)出相關(guān)耐藥基因。

5.從測(cè)序結(jié)果的可靠程度來(lái)講，不同的公司，對(duì)于可靠程度的數(shù)據(jù)采用不同的報(bào)告方法，如深度、覆蓋度、豐度、估測(cè)濃度、置信度，各有千秋，尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；同一公司相同樣本測(cè)序報(bào)告結(jié)果的穩(wěn)定性同樣也是需要更進(jìn)一步提升的因素。

2.2.3.2 tNGS法病原體檢測(cè)的操作流程及優(yōu)勢(shì)分析

針對(duì)mNGS方法在臨床上檢測(cè)靈敏度和成本的諸多問(wèn)題，tNGS可在增加樣本中病原微生物信息、提高靈敏度的前提下大大減少測(cè)序數(shù)據(jù)量，從而實(shí)現(xiàn)性能及成本的雙重優(yōu)化?？偟膩?lái)說(shuō)，tNGS 檢測(cè)包括以下幾個(gè)主要步驟：

1.  采集臨床樣本并進(jìn)行核酸抽提，針對(duì)RNA病毒進(jìn)行檢測(cè)還需補(bǔ)充反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA這一步驟；

2.  PCR靶向擴(kuò)增，設(shè)計(jì)針對(duì)感興趣病原微生物基因片段的特異性引物，靶向擴(kuò)增相關(guān)序列。這一步可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的目的，同時(shí)由于人源基因、定植菌基因及其他背景基因片段并未擴(kuò)增，因此有效地排除了背景DNA對(duì)于后續(xù)NGS的影響；

3.  第二輪PCR反應(yīng)并進(jìn)行NGS 建庫(kù)，

4.  PCR產(chǎn)物質(zhì)量檢測(cè)及NGS測(cè)序

5.  生信分析和檢測(cè)報(bào)告

圖5. tNGS 檢測(cè)流程（公開(kāi)資料整理）

如上文所介紹，傳統(tǒng)的多重PCR針對(duì)16S，18S等保守性較高的片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，不但無(wú)法保證超過(guò)30種以上病原微生物基因片段在一個(gè)反應(yīng)中的特異性擴(kuò)增，同時(shí)針對(duì)擴(kuò)增后的16S,18S片段進(jìn)行測(cè)序，也很難對(duì)病原體做到精確至種甚至亞種的分型。因此面對(duì)重度感染等復(fù)雜感染類型的病原體檢測(cè)，為了實(shí)現(xiàn)上百重甚至上千重的超多重PCR以增加病原體的一次檢出率，特異性擴(kuò)增的PCR引物序列及序列組的選取和設(shè)計(jì)至關(guān)重要。

除了引物設(shè)計(jì)之外，整個(gè)超多重PCR的體系優(yōu)化，包括細(xì)胞壁較厚的病原體如結(jié)核桿菌、真菌的破壁效率、非特異性擴(kuò)增的抑制、不同濃度模板的均勻擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的質(zhì)量檢測(cè)等等因素同樣是該領(lǐng)域的技術(shù)壁壘。

可以看出，tNGS用于臨床病原體的檢測(cè)，可在實(shí)現(xiàn)病原體精準(zhǔn)分型的前提下，同時(shí)進(jìn)行耐藥性及毒力等表型相關(guān)研究，切實(shí)滿足臨床訴求。

相比mNGS技術(shù)，tNGS在技術(shù)上有以下優(yōu)點(diǎn)：

1. 不受人類基因組及背景菌影響

tNGS法檢測(cè)目標(biāo)僅包含預(yù)先設(shè)定的致病病原體，PCR產(chǎn)物不包含人源基因片段及背景菌群基因片段，因此完全不會(huì)受到背景菌群的影響。

2. 大幅強(qiáng)化RNA病毒、胞內(nèi)菌 以及被吞噬病原體檢測(cè)能力

mNGS對(duì)RNA病毒檢測(cè)性能嚴(yán)重受制于人類基因表達(dá)水平的情況，而對(duì)于胞內(nèi)菌來(lái)說(shuō)，由于人類細(xì)胞中含有大量的人基因組，mNGS 檢測(cè)技術(shù)在進(jìn)行核酸抽提時(shí)，會(huì)避開(kāi)人類細(xì)胞，因此導(dǎo)致胞內(nèi)菌檢測(cè)效率低。tNGS完全不受此影響，tNGS技術(shù)會(huì)對(duì)RNA病毒的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)tNGS在核酸抽提過(guò)程中，無(wú)差別地抽提樣品中所有DNA, 大幅提高結(jié)核菌等胞內(nèi)菌，以及被白細(xì)胞吞噬病原體的檢出率。

3. 大幅強(qiáng)化表型基因檢測(cè)性能

tNGS法直接針對(duì)耐藥、毒力等基因進(jìn)行擴(kuò)增，可滿足針對(duì)病原體特定基因的檢測(cè)需求。

4. 強(qiáng)化病原抽提得率

tNGS法不但可以抽提得到血液中的游離DNA，此外，由于其無(wú)懼裂解人類細(xì)胞的特點(diǎn)，還可以抽提血液中白細(xì)胞內(nèi)的DNA，從而充分利用被白細(xì)胞所吞噬的病原體DNA，借此可以進(jìn)一步提升血液中病原體的檢出效率。

5.可以對(duì)病原體進(jìn)行真實(shí)定量檢測(cè)

由于基因組特異性序列比對(duì)的復(fù)雜性，目前mNGS難以將測(cè)序序列數(shù)對(duì)應(yīng)到病原

體真實(shí)含量。tNGS法可以通過(guò)簡(jiǎn)單的引入定量?jī)?nèi)參，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的真實(shí)定量檢測(cè)，獲得樣品中每個(gè)被檢出病原體的真實(shí)拷貝數(shù)。

6. 較低的檢測(cè)成本及耗時(shí)

tNGS樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量約為mNGS的千分之一。mNGS會(huì)對(duì)樣本中所有的核酸進(jìn)行檢測(cè)，所需時(shí)間較長(zhǎng)成本較高。tNGS技術(shù)只需針對(duì)特異性擴(kuò)增片段檢測(cè)，降低了檢測(cè)時(shí)間和成本。mNGS檢測(cè)目前市場(chǎng)價(jià)格約在5000元/次，而tNGS的檢測(cè)價(jià)格只需約1000元/次 。tNGS理論檢測(cè)時(shí)間只用12個(gè)小時(shí)，并且由于測(cè)序數(shù)據(jù)量較小，分析流程往往只需數(shù)分鐘，同時(shí)數(shù)據(jù)處理結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性明顯提升。

表2. mNGS技術(shù)與tNGS技術(shù)對(duì)比  

    上述病原體檢測(cè)方式及優(yōu)缺點(diǎn)概況：

圖6.病原體檢測(cè)方法示意圖（公開(kāi)資料整理）

3.1 病原微生物檢測(cè)市場(chǎng)空間巨大

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)感染性疾病患病人數(shù)可達(dá)每年10億人次。以傳染病為例，2018年我國(guó)傳染病發(fā)病人數(shù)超過(guò)777萬(wàn)人次，發(fā)病率和死亡率分別為559.41/10 萬(wàn)和1.68/10萬(wàn)，較2017年分別上升9.79%和14.88%。

圖7. 我國(guó)近年傳染病發(fā)病率（數(shù)據(jù)來(lái)源：Lancet, Nature, 國(guó)家疾病預(yù)防控制局）

我國(guó)每年感染性疾病患者中，超過(guò)3億的患者需使用病原檢測(cè)手段檢查進(jìn)一步輔助診斷，其中危重感染病人人數(shù)超1000萬(wàn)人，比如重癥肺炎發(fā)病人數(shù)每年約400萬(wàn)，膿毒血癥約560萬(wàn)，新發(fā)腦膜炎約85萬(wàn)。針對(duì)這些感染類型較為復(fù)雜的危重感染病例，目前常規(guī)檢測(cè)手段的無(wú)法滿足治療需求（圖8），而從宏基因組學(xué)出發(fā)的mNGS技術(shù)及tNGS技術(shù)可以覆蓋此類群體。

圖9. 病原檢測(cè)技術(shù)覆蓋度示意圖

除此之外，新發(fā)現(xiàn)病原微生物，以及耐藥性不斷增強(qiáng)甚至出現(xiàn)多重耐藥的病菌涌現(xiàn)，使得臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)性治療或常規(guī)治療時(shí)常會(huì)出現(xiàn)無(wú)效的現(xiàn)象。如SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒、寨卡病毒及埃博拉病毒感染等、這類疾病的傳染性極強(qiáng)，可能會(huì)造成世界性大流行，因此對(duì)此類病原體快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)為新型診斷技術(shù)創(chuàng)造了巨大的市場(chǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全球微生物診斷行業(yè)市場(chǎng)規(guī)模為161.6億美元，增速為4.75%，我國(guó)僅為 14 億美元左右，增速低于2% ，未來(lái)發(fā)展空間巨大。 

圖10. 全球微生物診斷市場(chǎng)規(guī)模及增速（數(shù)據(jù)來(lái)源：FDA， global data）

圖11.我國(guó)微生物診斷市場(chǎng)規(guī)模及增速（數(shù)據(jù)來(lái)源：FDA， global data，廣證恒生）

3.2 政策利好加速病原體檢測(cè)行業(yè)發(fā)展

我國(guó)是抗生素使用大國(guó)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)各類科室抗生素使用率為：門診患者30%、住院患者70%，其中外科患者達(dá) 97%～100%。WHO 推薦的抗菌藥物應(yīng)用率為 30%，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家約為 10.4%，我國(guó)的抗生素使用頻率遠(yuǎn)高于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)?？股氐臑E用引起的耐藥性問(wèn)題已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為21世紀(jì)最大的健康問(wèn)題之一。病原微生物的精準(zhǔn)檢測(cè)是避免盲目用藥，尤其是盲目使用抗生素的最有效手段。2015年出臺(tái)的《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》明確指出感染性疾病應(yīng)盡早查明感染病原，根據(jù)病原種類及藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果選用抗菌藥物?？咕幬锲贩N的選用，原則上應(yīng)根據(jù)病原菌種類及病原菌對(duì)抗菌藥物敏感性，即細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果而定。

自2016年以來(lái)，國(guó)家逐步出臺(tái)眾多政策限制對(duì)抗生素的濫用，規(guī)定了臨床抗生素的使用必須基于病原學(xué)證據(jù)?？梢钥闯?，多項(xiàng)指導(dǎo)政策出臺(tái)，嚴(yán)控抗生素使用，支持、鼓勵(lì)、規(guī)范感染性疾病的精準(zhǔn)檢測(cè)，尤其是對(duì)病原體精準(zhǔn)分型以及耐藥性評(píng)估等內(nèi)容。病原微生物檢測(cè)行業(yè)在政策的助力下，具有巨大的發(fā)展前景。

表3. 病原微生物檢測(cè)相關(guān)政策法規(guī)

來(lái)源：政府官網(wǎng)，探針資本整理

4.1 mNGS相關(guān)公司及產(chǎn)品介紹

國(guó)內(nèi)目前已有數(shù)家提供mGNS微生物檢測(cè)服務(wù)的公司，包括華大基因、賽哲生物、金匙基因、譜元科技、博奧生物、達(dá)瑞生物、永諾生物、迅敏康等老牌或新興基因測(cè)序服務(wù)公司?，F(xiàn)選取前四家進(jìn)行相關(guān)分析介紹。

表4. 部分mNGS產(chǎn)品介紹

    4.1.1華大基因

公司主營(yíng)業(yè)務(wù)為通過(guò)基因檢測(cè)、質(zhì)譜檢測(cè)、生物信息分析等手段，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)、科研機(jī)構(gòu)、企事業(yè)單位等提供基因組學(xué)類的檢測(cè)和研究服務(wù)。業(yè)務(wù)范圍涵蓋生育健康相關(guān)的基因檢測(cè)研究和臨床應(yīng)用服務(wù)，腫瘤基因檢測(cè)、標(biāo)志物測(cè)定和用藥指導(dǎo)基因檢測(cè)，感染病原檢測(cè)分析，多組學(xué)大數(shù)據(jù)服務(wù)與合成四大板塊。在mNGS技術(shù)方面，華大基因利用自有的 BGISEQ 測(cè)序平臺(tái)，是國(guó)內(nèi)率先開(kāi)始進(jìn)行宏基因組高通量測(cè)序病原檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的企業(yè)之一。公司推出主力產(chǎn)品PMseq感染病原高通量基因檢測(cè)，并逐漸滲透到臨床并得到了臨床的廣泛認(rèn)可。近幾年來(lái)，與北京協(xié)和醫(yī)院聯(lián)合開(kāi)展基于宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)的腦炎腦膜炎多中心病原微生物檢測(cè)研究，與復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院、華山醫(yī)院等開(kāi)展基于宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)的多中心病原微生物檢測(cè)研究，經(jīng)過(guò)幾年的技術(shù)積累，以病原高通量測(cè)序技術(shù)為代表的微生物檢測(cè)技術(shù)對(duì)于感染精準(zhǔn)防控起到了重要的推動(dòng)作用，并得到了臨床的廣泛認(rèn)可。

4.1.2賽哲生物

賽哲生物主營(yíng)業(yè)務(wù)主要包括大類：病原微生物體外診斷試劑研發(fā)、高通量測(cè)序+個(gè)性化生物信息學(xué)分析+實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證+生物美學(xué)、自主科研試劑生產(chǎn)銷售和品牌儀器試劑及耗材代理銷售。目前公司業(yè)務(wù)收入構(gòu)成均來(lái)自第二類和第三類，即為客戶提供第二類的科研服務(wù)和提供第三類的貿(mào)易產(chǎn)品。2019年公司以高通量病原微生物快速檢測(cè)服務(wù)為核心，專注病原微生物預(yù)防、診斷和精準(zhǔn)治療，利用現(xiàn)有研發(fā)平臺(tái)、科技服務(wù)平臺(tái)、生信分析平臺(tái)、儀器平臺(tái)和試劑生產(chǎn)平臺(tái)，與國(guó)內(nèi)外 500 多家醫(yī)療及科研單位建立合作關(guān)系，全面推廣宏基因組測(cè)序技術(shù)在感染性疾病診斷市場(chǎng)的廣泛應(yīng)用。

4.1.3 金匙基因

金匙基因于2017年創(chuàng)建于北京大學(xué)生命科學(xué)院產(chǎn)業(yè)孵化器，2018年金匙基因確立了以高通量測(cè)序用于病原微生物診斷的業(yè)務(wù)方向，對(duì)二代基因測(cè)序、三代基因測(cè)序和基因編輯技術(shù)應(yīng)用于疾病診斷領(lǐng)域展開(kāi)研發(fā)，目前公司建設(shè)了3000平米的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所和研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，建立了以Illumina測(cè)序儀為主的二代測(cè)序平臺(tái)和以Nanopore測(cè)序儀為主的三代測(cè)序平臺(tái)。2019年3月，病原診斷公司金匙基因宣布完成數(shù)千萬(wàn)人民幣的A輪融資。本輪融資的投資方為君聯(lián)資本，所募集資金將用于高通量病原診斷產(chǎn)品。

4.1.4 譜元科技有限公司

譜元科技成立于2014年，公司發(fā)展致力于科技服務(wù)、微生態(tài)健康、臨床檢測(cè)三大領(lǐng)域的技術(shù)開(kāi)發(fā)和產(chǎn)品服務(wù)，業(yè)務(wù)范圍包括營(yíng)養(yǎng)與腸道微生物研究、臨床病原微生物檢測(cè)等。譜元科技在微生態(tài)樣品檢測(cè)方面與中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究研究、中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院等機(jī)構(gòu)合作建立多個(gè)微生態(tài)檢測(cè)研發(fā)平臺(tái)；與北京大學(xué)人民醫(yī)院、美國(guó)國(guó)家癌癥研究中心等單位建立合作關(guān)系。

4.2 tNGS相關(guān)公司

tNGS技術(shù)的超多重PCR體系由于壁壘較高，目前僅僅被少數(shù)幾家公司所掌握。從全球范圍看，目前發(fā)展較為成熟的只有位于美國(guó)的Thermo Fisher,Paragon Genomics公司以及國(guó)內(nèi)的上海冰緣醫(yī)療科技有限公司以及杭州聯(lián)川生物技術(shù)公司。

4.2.1 Thermo Fisher

超多重PCR技術(shù)最早被Life technology corporation這一全球生物科學(xué)及化工領(lǐng)域絕對(duì)的頭部公司所開(kāi)發(fā)，同時(shí)也是現(xiàn)今最為成熟的超多重PCR體系，可實(shí)現(xiàn)超過(guò)萬(wàn)重的全基因組特異性擴(kuò)增。隨著Life technology 2014年被賽默飛收購(gòu), 其tNGS技術(shù)平臺(tái)Ion AmpliSeq technology成為Thermo旗下產(chǎn)品。

Ion AmpliSeq 技術(shù)是全球公認(rèn)的tNGS金標(biāo)準(zhǔn)，是現(xiàn)有最快、最簡(jiǎn)單、且最具可擴(kuò)展性的 NGS 解決方案。在超多重PCR panel設(shè)計(jì)方面，Ion AmpliSeq panel 以 Ready-to-Use（即用型）、Made-to-Order（自定義定制型）、HD Made-to-Order（超高靈敏度自定義定制型）和On-Demand（基因按需定制型）形式提供，由寡核苷酸對(duì)引物庫(kù)組成，每對(duì)引物均設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增特定的基因組區(qū)域。每一種 Panel 均可用于研究某個(gè)基因之中的所有堿基，或用于集中研究特定的突變熱點(diǎn)應(yīng)用領(lǐng)域。產(chǎn)品可檢測(cè)的范圍如下圖所示。

圖12. Ion AmpliSeq技術(shù)檢測(cè)范圍（來(lái)源：公司官網(wǎng)）

其中，Ready-to-Use的13種定型產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)了對(duì)于癌癥以及部分遺傳病相關(guān)基因的高比例覆蓋。

圖13.13款定型產(chǎn)品檢測(cè)位點(diǎn)覆蓋度（來(lái)源：公司官網(wǎng)）

Thermo的超多重PCR體系可實(shí)現(xiàn)對(duì)于含量低至1ng的模板特異性檢出，性能優(yōu)異。但目前其tNGS產(chǎn)品僅適配于自家Ion Torrent測(cè)序儀，限制了該類產(chǎn)品的實(shí)際應(yīng)用范圍。

表5. Ion AmpliSeq panel參數(shù)概覽

來(lái)源：公司官網(wǎng)

     4.2.2 Paragon Genomics

Paragon genomics公司成立于2015年，致力于突破基因檢測(cè)領(lǐng)域靶向測(cè)序準(zhǔn)確度及覆蓋率低、成本高及時(shí)間長(zhǎng)等瓶頸，創(chuàng)始團(tuán)隊(duì)本身具有Life Technology背景。公司開(kāi)發(fā)的超高多重PCR生物試劑平臺(tái)技術(shù)CleanPlex?，已于2016年10月獲得專利。產(chǎn)品同樣包括Ready-to-use定型panel以及定制化panel兩類方案。公司主要合作伙伴有：加州大學(xué)舊金山分校醫(yī)療中心、安諾優(yōu)達(dá)、華大基因、Gen Era Diagnostics、USDA-ARS 等。Paragon genomics 公司于2017年9 月完成800萬(wàn)美元A輪融資，由復(fù)星、凱風(fēng)創(chuàng)投領(lǐng)投。

公司的CleanPlex? tNGS平臺(tái)包含2個(gè)技術(shù)核心，分別為自有高性能引物設(shè)計(jì)算法以及專利授權(quán)的背景預(yù)處理過(guò)程。其中背景預(yù)處理過(guò)程涉及到整個(gè)超多重PCR的核心反應(yīng)。共分為3部分，每一部分都包含一個(gè)熱循環(huán)或孵育反應(yīng)：1.多重PCR靶向擴(kuò)增感興趣的基因；2.引物二聚體，非特異性PCR產(chǎn)物以及復(fù)雜分子碎片通過(guò)自主研發(fā)的消化體系去除；3.文庫(kù)被樣本特異性條形碼修飾。其中第二步對(duì)于最終的NGS結(jié)果起到至關(guān)重要的作用，它保證了只有感興趣的DNA序列才會(huì)被進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镹GS文庫(kù)中的分子，從而充分高效地利用測(cè)序讀數(shù)。

圖14.背景去除消化技術(shù)對(duì)于NGS測(cè)序信號(hào)的影響

（來(lái)源：公司官網(wǎng)）

CleanPlex?的tNGS文庫(kù)制備的速度大約為2.5小時(shí)左右，已基本達(dá)到行業(yè)目前的最快水平，并且實(shí)現(xiàn)低至10ng的模板檢出。目前該平臺(tái)的應(yīng)用領(lǐng)域集中在腫瘤治療、藥物基因檢測(cè)以及分子育種三個(gè)方面，對(duì)病原體檢測(cè)未有涉及。

4.2.3 上海冰緣醫(yī)療科技有限公司

上海冰緣醫(yī)療科技有限公司是全國(guó)首家，同時(shí)也是全球目前唯一掌握超多重PCR技術(shù)并將其用于病原微生物檢測(cè)的公司。冰緣醫(yī)療成立于2019年7月，下設(shè)上海茂槿生物技術(shù)有限公司及石家莊安哲衛(wèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室兩個(gè)子公司，致力于解決目前臨床病原體診療領(lǐng)域存在的多種問(wèn)題。

冰緣的控股子公司茂槿生物2015年成立，長(zhǎng)期以來(lái)提供tNGS panel的定制服務(wù),已完成超過(guò)100個(gè)超多重PCR體系的定制化生產(chǎn)，部分產(chǎn)品擁有超越Thermo Fisher的擴(kuò)增性能表現(xiàn)，同時(shí)完成過(guò)多個(gè)超過(guò)千重，最大超過(guò)2000重的定制項(xiàng)目，tNGS設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)豐富，體系成熟，定制panel從確定確定位點(diǎn)、panel設(shè)計(jì)、設(shè)計(jì)確認(rèn)、panel合成、測(cè)試和優(yōu)化至最終交付客戶僅需要一個(gè)月時(shí)間。目前多款產(chǎn)品已實(shí)現(xiàn)商業(yè)可用。

在技術(shù)難度相對(duì)更高的病原體tNGS檢測(cè)領(lǐng)域，公司現(xiàn)已推出三款針對(duì)不同臨床需求的LDT病原微生物檢測(cè)試劑盒，詳情如下圖所示。其中針對(duì)下呼吸道感染的Pathogeno Lung系列產(chǎn)品已積累了超過(guò)2000例的臨床驗(yàn)證性數(shù)據(jù)，產(chǎn)品性能得到臨床的肯定與證實(shí)。同時(shí)正在開(kāi)發(fā)基于微流控毛細(xì)管電泳的甲乙型流感病毒快速分型產(chǎn)品，切實(shí)解決臨床未被滿足的檢測(cè)需求。

圖15. 冰緣醫(yī)療LDT產(chǎn)品研發(fā)管線

4.2.4 聯(lián)川生物技術(shù)公司

杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司成立于2006年，是國(guó)家級(jí)高新技術(shù)企業(yè)，全球少數(shù)幾家掌握基因捕獲核心技術(shù)的高科技公司。2016年創(chuàng)立全資子公司杭州聯(lián)川基因診斷技術(shù)有限公司，提供從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)到代謝組學(xué)的跨組學(xué)整合分析服務(wù)。在精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域，公司成功研發(fā)出世界領(lǐng)先的VariantPro?基因捕獲技術(shù)，實(shí)現(xiàn)一步法精準(zhǔn)捕獲目標(biāo)基因，并已成功開(kāi)發(fā)出多款腫瘤液態(tài)活檢檢測(cè)試劑盒。在VariantPro?一步式靶向基因捕獲技術(shù)的基礎(chǔ)上，依托專利的OmegaPrimer?引物合成技術(shù)，通過(guò)多重PCR的方式進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增。

OmegaPrimer?是一形似Ω的引物序列，5’臂設(shè)計(jì)的較長(zhǎng)，保證引物穩(wěn)定結(jié)合模板，3’臂設(shè)計(jì)雙重檢查結(jié)合特異性并啟動(dòng)聚合酶延伸，兩臂之間的loop區(qū)2起到間隔作用，同時(shí)又為后續(xù)文庫(kù)擴(kuò)增提供通用引物雜交序列。聯(lián)川的超多重PCR體系超多重靶向擴(kuò)增環(huán)節(jié)僅進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)，便切換至通用引物的擴(kuò)增。目前公司已有的產(chǎn)品包括腫瘤基因檢測(cè)和遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)領(lǐng)域。