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血小板在創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)中的重要生理作用，為人類(lèi)血小板衍生物在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。儲(chǔ)存在血小板顆粒中的大量生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子可以通過(guò)凝血酶激活和凝固自然釋放，也可以通過(guò)冷凍/解凍介導(dǎo)的血小板溶解、超聲或化學(xué)治療人工釋放。以不同的釋放策略制備的人血小板裂解物被視為可以替代胎牛血清（FBS）作為培養(yǎng)基補(bǔ)充劑的合適選擇，使人類(lèi)細(xì)胞在無(wú)動(dòng)物血清條件下高效增殖，在體細(xì)胞治療和組織工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。 1，血小板及其裂解物簡(jiǎn)介 生理狀態(tài)下，血小板的生命周期只有8-10天，每天必須從巨核細(xì)胞中產(chǎn)生大約（15-40）x109個(gè)血小板，以維持正常的（1.5-4.5）x105/μL的血小板計(jì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)血小板具有組織修復(fù)能力源于1969年《nature》雜志發(fā)表文章，使用自體富血小板血漿（PRP）添加到培養(yǎng)基來(lái)“培育”微血管內(nèi)皮細(xì)胞，以保證移植灌注器官中血管完整性[1]。這篇文章也拉開(kāi)PRP在臨床上的火爆應(yīng)用的序幕。到20世紀(jì)80年代，用血液里的血小板濃縮物反復(fù)冷凍/解凍和超聲處理制備成人血小板裂解液(HPL)，被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和原代成纖維細(xì)胞的增殖[2, 3]。隨后對(duì)血小板衍生的多種生長(zhǎng)因子進(jìn)行深入分析表明血小板在血管再生和傷口愈合中起比較好的作用[4]。血小板主要在其α顆粒中儲(chǔ)存了多種生物活性介質(zhì)[5-7]，包括各種趨化因子和生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF-AA、-AB和-BB）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等等，如下圖所示。 活化的血小板不僅釋放蛋白質(zhì)，而且釋放細(xì)胞微囊泡[8, 9]。血小板也含有miRNA[10]和mRNA[11]，這可能是在血小板形成過(guò)程中從巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)來(lái)的。
一旦組織和血管損傷，活化的血小板聚集和脫顆粒，釋放凝血因子開(kāi)始初級(jí)止血。同時(shí)，血小板活化后釋放其顆粒內(nèi)容物，其中的促炎細(xì)胞因子和趨化因子吸引巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞來(lái)清除受損的細(xì)胞和組織，以及幫助抵抗細(xì)菌污染[12]。這些介質(zhì)的刺激和抑制作用引起成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而導(dǎo)致血管重塑和組織修復(fù)[6]。血小板在調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的多方面作用也得到了詳細(xì)的綜述[13, 14]。由于血小板的α顆粒所含的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的復(fù)雜性和異質(zhì)性，導(dǎo)致血小板激活所釋放的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子存在明顯的個(gè)體化和制備批次之間的差異[15, 16]。相對(duì)于FBS，HPL來(lái)源個(gè)體之間和制備批次之間的差異更大，導(dǎo)致最終產(chǎn)品的質(zhì)量以及對(duì)細(xì)胞生物學(xué)和功能的影響有很大的不同[17]。正是因?yàn)榕沃g的差異巨大，所以目前對(duì)HPL是否能代替FBS，存在一些爭(zhēng)議。2005年首次報(bào)道人血小板裂解物(HPL)可以代替胎牛血清用于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的大規(guī)模培養(yǎng)和制備，能滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的需求[18]。隨后有一系列的文章證明HPL能起到FBS的功能，促進(jìn)MSC的增殖擴(kuò)增[17, 19]。這種高效的細(xì)胞增殖刺激使MSCs能夠在11-16天的單個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模的臨床應(yīng)用，而不需要進(jìn)一步的傳代，同時(shí)保持基因組的穩(wěn)定性[20]。當(dāng)MSC接種在羥基磷灰石-磷酸三鈣(HA/TCP)生物材料上生長(zhǎng)，5%的HPL對(duì)牙髓MSCs的增殖有明顯的促進(jìn)作用，然而，HPL的濃度提高到10%時(shí)，10%的HPL卻顯著抑制MSC增殖；而且5%的HPL明顯促進(jìn)MSC在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的成骨分化[21]。另有研究顯示任何濃度的HPL（1%-60%）促進(jìn)脂肪MSC增殖的效果均優(yōu)于10%的FBS，而且20%HPL的效果最佳[22]。
HPL培養(yǎng)能提高脂肪MSC的增殖和向軟骨分化，有利于治療修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷[23]。活化的血小板釋放的細(xì)胞因子在腫瘤轉(zhuǎn)移和關(guān)節(jié)炎中也一些不好的作用[24, 25]。有報(bào)道稱(chēng)骨髓MSC在僅添加HPL的培養(yǎng)基中擴(kuò)增效率較低[26]。一些研究顯示血小板裂解物培養(yǎng)MSC后，MSC的成骨或成脂分化能力降低[27]，以及表面標(biāo)志表達(dá)改變和降低MSC的免疫抑制能力[28]。盡管血漿被認(rèn)為含有許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)激素和IGF-1等因子，但是缺乏血小板活化釋放的多種生長(zhǎng)因子，因此單純的血漿很少用于培養(yǎng)MSC的補(bǔ)充劑[17]。血液經(jīng)過(guò)凝固后釋放出血清，因涉及血小板的激活，因而含有多種生長(zhǎng)因子，但是血清樣本中生長(zhǎng)因子的含量比濃縮血小板產(chǎn)生的HPL低30%至50%[29]。3，血小板裂解物（HPL）的制備 簡(jiǎn)而言之，這些HPL濃縮液可以通過(guò)以下方法制備（見(jiàn)下圖）：(A)Buffy Coat法(主要在歐洲使用)或(B)PRP法(主要在美國(guó)和亞洲使用)，或(C)通過(guò)血小板抗凝技術(shù)(在世界各地使用)制備。技術(shù)流程圖如下。200-300毫升的血液，大概可以得到200毫升的富含血小板的血漿。這個(gè)制備過(guò)程需要去除白細(xì)胞，使白細(xì)胞減少到低于5x106個(gè)/單位（美國(guó)）或低于1x106個(gè)/單位（歐洲）。血小板濃縮物可以保存在血漿中或血漿和血小板添加劑溶液的混合物中，其中含有氯化鈉/鉀、檸檬酸鹽、磷酸鹽和甘露醇[30]。誘導(dǎo)血小板釋放生長(zhǎng)因子和其他生物活性分子的四大方法：（1）多次冷凍/解凍循環(huán)（反復(fù)凍融法）：多次冷凍/解凍循環(huán)是最常見(jiàn)和最簡(jiǎn)單的，兼有效和經(jīng)濟(jì)的方式誘導(dǎo)血小板激活釋放因子。典型的情況是，濃縮的血小板在-80℃時(shí)被休克冷凍，37℃時(shí)解凍，從而使血小板激活和碎裂[18, 31]。HPL制備工藝的最后一步是分裝和質(zhì)量檢測(cè)，合格后放行使用。到目前為止，文獻(xiàn)中描述的循環(huán)周期數(shù)從1到5不等，尚待進(jìn)行系統(tǒng)的分析，以確定凍融循環(huán)的最佳次數(shù)和精確條件。這種方法是加入鈣鹽溶液(通常是CaCl2)[23]，以激活內(nèi)源性凝血酶，從而纖維蛋白形成和血小板脫顆粒。也有人或重組凝血酶的直接激活[22]，但重組凝血酶的使用可能會(huì)使HPL用于細(xì)胞治療的監(jiān)管和批準(zhǔn)復(fù)雜化。30多年來(lái)，超聲單獨(dú)或與冷凍/解凍循環(huán)相結(jié)合也被用作一種快速、高效和經(jīng)濟(jì)高效的釋放血小板的方法。在20 kHz頻率下超聲作用30分鐘可有效釋放血小板顆粒含量[32]。從制備工藝上來(lái)說(shuō)，S/D處理法略微復(fù)雜。用1%磷酸三丁酯(TNBP)和1%的TritonX-100在30℃下處理新鮮冷凍血漿（FFP）4小時(shí)，制備S/D-FFP。添加的試劑用大豆油萃取和不溶性C18樹(shù)脂層析除去。用S/D-FFP免疫家兔，然后用未經(jīng)處理的FFP吸附誘導(dǎo)的抗體，證實(shí)沒(méi)有新的免疫原的形成[33]。這種方法還有一個(gè)好處就是可以滅活被脂質(zhì)包裹的病毒[33]。不同的制備技術(shù)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的含量和組成產(chǎn)生重大影響[34]。HPL的蛋白質(zhì)含量和組成的變化如何影響MSC的增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)作用，當(dāng)然值得進(jìn)一步研究[35]。HPL里面的生長(zhǎng)因子在血漿中很可能不穩(wěn)定，因此注意低溫保護(hù)[36]。溫度、血漿保存時(shí)間、HPL制劑的反復(fù)凍融步驟對(duì)HPL的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)功能以及最終對(duì)MSC的干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚未得到充分評(píng)價(jià)。在兩份報(bào)告中，有證據(jù)表明反復(fù)冷凍/解凍對(duì)生長(zhǎng)因子含量有相當(dāng)負(fù)面的影響，誘導(dǎo)MSC高表達(dá)HLA-DR[37, 38]。HLA-DR高表達(dá)，意味著MSC能促發(fā)人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致MSC進(jìn)入人體后快速地被人體所清除。
4，自體和異體HPL 自體HPL通常從全血標(biāo)本中通過(guò)離心和分離PRP后獲得，另有一個(gè)可選的離心步驟為濃縮血小板。與異體HPL生產(chǎn)一樣，血小板激活是通過(guò)冷凍/解凍循環(huán)或在PRP中加入CaCl2或凝血酶來(lái)誘導(dǎo)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白凝塊、血小板活化和生長(zhǎng)因子釋放。相對(duì)于異體，自體HPL的優(yōu)點(diǎn)包括避免了供體來(lái)源的血漿攜帶病毒的任何可能風(fēng)險(xiǎn)。然而，在實(shí)踐中，自體HPL的體積可能不足以滿(mǎn)足臨床細(xì)胞劑量。因此，自體HPL的使用可能僅限于需要少量MSC的應(yīng)用。異體HPL的風(fēng)險(xiǎn)在于潛在的人類(lèi)血液傳播病原體（比如HIV、HBV、HCB和梅毒等等），這一風(fēng)險(xiǎn)可以通過(guò)目前在持照血液中心采用的獻(xiàn)血者篩選和檢測(cè)戰(zhàn)略以及病原體滅活而大大降低。其實(shí)，自體HPL并非沒(méi)有風(fēng)險(xiǎn)，這取決于自體本身是否攜帶各種致病病毒。雖然需要進(jìn)行研究以確定捐獻(xiàn)者年齡對(duì)細(xì)胞行為的影響，但單個(gè)捐獻(xiàn)者的影響可能不那么重要，并將通過(guò)大規(guī)模制造同種異體HPL所需的集合來(lái)消除[29, 39]。下表總結(jié)了自體HPL和同種HPL各自的優(yōu)點(diǎn)和局限性。 5，血型對(duì)MSCs的培養(yǎng)有沒(méi)有影響？ 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不到可溶性AB抗原在骨髓MSC上的吸附[40]。這個(gè)可能與血漿或HPL的濃度有關(guān)。MSC在100%的AB血漿中孵育3h后從新鮮人AB血漿中吸附了少量的ABO抗原，這與抗原濃度和吸附時(shí)間有關(guān)；用AB血漿洗滌的MSCs在體外暴露于健康獻(xiàn)血員的血液后引起更強(qiáng)的血液反應(yīng)，并含有高滴度的ABO抗體；而10%AB血漿則不會(huì)出現(xiàn)這樣的情況[41]。因此，用AB血漿制備的HPL培養(yǎng)MSC可以考慮避免給O血型人群使用。6，PRP、PRF和HPL的區(qū)別 PRP：platelet-rich plasma，即富含血小板血漿PRF：platelet-rich fibrin，即富含血小板纖維蛋白HPL：Human platelet lysate，即人血小板裂解物看名稱(chēng)就能大概判斷這三者的區(qū)別。PRP去掉血小板、PRF去掉血小板和纖維蛋白，即可得到HPL；HPL只含血漿和血小板激活后釋放的因子。各自有各自的生理功能和用途，這里不在詳述。PRP只是HPL生產(chǎn)制備過(guò)程中的中間產(chǎn)品！PRP≠干細(xì)胞，PRP不含有干細(xì)胞，如果有人用PRP當(dāng)作干細(xì)胞來(lái)宣傳，那就是忽悠。PRP和PRF的區(qū)別參照下圖，根據(jù)是否含白細(xì)胞，PRP和PRF還各自分兩種： 7，總結(jié)
血小板裂解物和胎牛血清，各自有利弊，只是這些年大家對(duì)血小板裂解物的熱情比較高漲，有適合細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化所需的宣傳亮點(diǎn)（安全性、無(wú)動(dòng)物源成份）。其實(shí)，認(rèn)為血小板裂解物比胎牛血清更安全，這是“想當(dāng)然”的思維。血小板裂解物一樣面臨著很多安全性問(wèn)題，人類(lèi)傳染性病毒尤為常見(jiàn)。雖然胎牛血清是異種血清制品，但是很多牛的病毒并不具有人致病性，常見(jiàn)為引起免疫反應(yīng)。而胎牛血清引起免疫反應(yīng)的臨床處理明顯簡(jiǎn)單于人類(lèi)傳染性病毒所導(dǎo)致的疾?。ò滩?、乙肝等都是極難治愈）。所以，只要制備干細(xì)胞和免疫細(xì)胞的企業(yè)能保障安全性，注重各種致病微生物的檢測(cè)，血小板裂解物和胎牛血清都是可以使用的。歐盟和美國(guó)FDA都沒(méi)有禁止胎牛血清的應(yīng)用，只是要求保障安全性！鼓吹血小板裂解物優(yōu)于胎牛血清，是否帶來(lái)大量血小板需求所導(dǎo)致的監(jiān)管問(wèn)題？注：本文發(fā)表于2019年3月31日 參考文獻(xiàn)：略（暫不提供）
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