干細(xì)胞行業(yè)的葵花寶典：MSC的培養(yǎng)方法總匯

山峰云繞 2019-03-30

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人生小哲理干細(xì)胞者說

科普相當(dāng)重要

尤其是前沿?zé)狳c

比如干細(xì)胞

正文

路在腳下延伸，每前進一步都距離真理更近一步。

撰文：東海先生

來源：間充質(zhì)干細(xì)胞

分離MSC，是研究和應(yīng)用MSC的第一步。

培養(yǎng)MSC，是研究和應(yīng)用MSC的第二步。

大規(guī)模體外培養(yǎng)擴增高質(zhì)量的MSC，是干細(xì)胞企業(yè)所追求的。那么建立合適的培養(yǎng)體系就顯得非常重要，而培養(yǎng)基是重中之重。相信有些干細(xì)胞企業(yè)都有屬于自己的培養(yǎng)基專利，但是擁有專利不等于這個專利能培養(yǎng)出高質(zhì)量的MSC。培養(yǎng)基配方稍加改動，就可以產(chǎn)生新的專利，而且專利的本質(zhì)不在于追求培養(yǎng)出高品質(zhì)的MSC。中草藥眾多、成份復(fù)雜多樣化，所以在MSC培養(yǎng)基中添加不同的中藥材成份，既可產(chǎn)生很多很多專利（拿走不謝）。

不同的實驗或者企業(yè)，MSC的培養(yǎng)體系很可能不同。

比如有實驗室培養(yǎng)MSC到第9代已經(jīng)出現(xiàn)80%的衰老（SA-gal染色陽性）[1]，而有的實驗室培養(yǎng)到第11代也只是40%的MSC出現(xiàn)衰老[2]。有的實驗室骨髓MSC只能擴增到第10代，臍帶、臍帶血、羊膜來源的MSC也只能擴增到12-14代[3]。但也有實驗室能做到臍帶MSC的培養(yǎng)能有效擴增到40代，依然具有多向分化潛能[4]?？梢姴煌瑢嶒炇业呐囵B(yǎng)體系對MSC的擴增效能有明顯的差異。

MSC的細(xì)胞質(zhì)量伴隨著衰老快速下降（見圖）

MSC的體外擴增培養(yǎng)，不可避免地出現(xiàn)復(fù)制衰老（replicative senescence）[1, 2, 5,6]，過度擴增還可能伴隨著基因組的不穩(wěn)定性[7-9]，影響到MSC的干細(xì)胞功能[10]。相對于老鼠的MSC，人MSC的基因組穩(wěn)定性比較好，而且不具有成瘤性[11-13]。

那么MSC細(xì)胞衰老的最直觀表現(xiàn)有哪些？增殖速度減慢和胞體變大扁寬是所有細(xì)胞衰老的特征[14]。

細(xì)胞核型分析顯示，骨髓MSC在培養(yǎng)至18代的時候出現(xiàn)了染色體異常和端粒酶縮短[11]，而臍帶MSC在培養(yǎng)至30代才會出現(xiàn)染色體異常[13]。但是一般都會應(yīng)用10代前的MSC，所以不用擔(dān)心染色體異常的問題。

所以，MSC細(xì)胞培養(yǎng)體系很重要！培養(yǎng)基、氧分壓和培養(yǎng)載體是三個關(guān)鍵因素。

1. 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)有DMEM、DF-12、αMEM、IMDM等。不同基礎(chǔ)培養(yǎng)對MSC大規(guī)模擴增有沒有影響？目前這方面的研究極少。2018年的一篇文章證明以DMEM為基礎(chǔ)的擴增培養(yǎng)基能更好地促進人骨髓MSC在早期傳代(P4)中的增殖，但是在P5代后，DMEM就略遜色于αMEM（見下圖）[15]。不過，這個培養(yǎng)體系下，只是到P8代，MSC的倍增時間就達到8天，那就說明這個培養(yǎng)體系沒法支撐MSC的長期培養(yǎng)，還有優(yōu)化的空間。

更多的研究關(guān)注于補充液對MSC體外培養(yǎng)的影響。

胎牛血清（FBS）是研究實驗室中最常見的培養(yǎng)補充液。有專家認(rèn)為胎牛血清有幾個劣勢：成本高、批次變異(產(chǎn)生于其1800種蛋白質(zhì)和4000種代謝物的不同濃度)、可用性有限(只有三分之一的胎牛血清產(chǎn)品符合細(xì)胞治療的監(jiān)管要求)、各種豬的病毒污染和以及引起異種免疫反應(yīng)的可能性等等問題[16-18]。因此，2019年的一篇綜述認(rèn)為FBS的使用可能被認(rèn)為不足以培養(yǎng)臨床應(yīng)用的MSCs[19]。其實，通過多次洗滌的方法，可以將胎牛血清蛋白降到非常低的水平而不足于引發(fā)免疫反應(yīng)。

歐盟2013年有文件《Guideline on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products》規(guī)定胎牛血清供應(yīng)方需要提供安全性檢測，關(guān)鍵是不能污染了各種病毒（bluetongue and related orbiviruses、bovine adenovirus、bovine parvovirus、bovine respiratory syncytial virus、bovine viral diarrhoea virus、rabies virus、reovirus 3、bovine viraldiarrhoea virus、bovine polyoma virus等）。

和歐盟的態(tài)度一樣，美國FDA并不反對胎牛血清的應(yīng)用。但FDA對胎牛血清的描述就沒有歐盟那么具體，只需要保證胎牛血清不能來自疫區(qū)，明確提及不能污染口蹄疫病毒和瘋牛病病毒。

比如對病毒疫苗的生產(chǎn)就需要用到胎牛血清，F(xiàn)DA官網(wǎng)是這樣描述的：“Viral vaccines are produced in living cells, which, similarly, require the addition ofcomplex growth media components, such as fetal calf serum.”fetal calf serum指的就是胎牛血清。

澳大利亞治療品管理局允許使用FBS生產(chǎn)臨床級材料，只要它來自澳大利亞或新西蘭等沒有瘋牛病疫情的國家的牛。

臨床對照實驗顯示MSC臨床應(yīng)用的安全性，MSC治療不會增加感染的風(fēng)險，MSC治療組和對照組在惡液質(zhì)和成瘤方面沒有差異。Meta分析發(fā)現(xiàn)MSC治療與發(fā)燒存在一定的關(guān)聯(lián)性，而與其他文獻所報道的不良反應(yīng)沒有必要的聯(lián)系。那么發(fā)燒是否與培養(yǎng)基添加胎牛血清有關(guān)？有關(guān)聯(lián)，但是胎牛血清不是引起發(fā)燒的唯一因素。

為了避免與FBS相關(guān)的不良并發(fā)癥，開發(fā)了可替代動物血清的培養(yǎng)基。最常用的是人AB血清(HABS)、人血小板裂解物(HPL)和化學(xué)限定培養(yǎng)基(CDM)。

然而，這些替代方案依然存在自身的局限性。HABS和HPL均存在病毒（HIV、HBV、HCV、梅毒等）污染的可能性，而且不同批次之間有明顯的差異[20]。成人供者的HABS（血清）在保留MSC重要特性的情況下能否比FBS更能促進MSC增殖的作用是有爭議的[21-23]。

比如美國波士頓的塔夫茨-新英格蘭醫(yī)療中心的研究員發(fā)現(xiàn)人HABS在促進臍帶MSC增殖方面不如胎牛血清，而且HABS培養(yǎng)臍帶MSC容易成團（見下圖）。

人血小板裂解物(HPL)最近成為一種更受歡迎的人類產(chǎn)品，可以代替胎牛血清[22, 24]。血小板在冷凍/解凍過程中被激活，釋放多種生長因子，再通過離心以清除血小板小體。獲得的生長因子包括血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）、血小板衍生生長因子AB（PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、胰島素生長因子-1(IGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等[24, 25]，這些因子以劑量依賴的方式提高了MSC的增殖能力。添加5%的HPL的培養(yǎng)基在克隆形成效率和增殖能力方面優(yōu)于10%FBS，從而提供了更有效的MSCs擴增[24]。

然而，一些研究顯示血小板裂解物的局限性，包括成骨或成脂分化能力降低[26]，以及表面標(biāo)志表達改變和降低MSC的免疫抑制能力[20]。

此外，蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，從外周血中獲得的HPL含有促炎因子CCL3和CCL5，這些因子可能影響MSC的功能[20]。和胎牛血清培養(yǎng)MSC相比，HPL培養(yǎng)的MSC出現(xiàn)免疫抑制功能減弱的情況[20]。

化學(xué)限定培養(yǎng)基(CDM)因為不含血清，能避免血清制品帶來的潛在風(fēng)險。常見的CDM有RoosterNourish (Rooster Bio), Mesencult-XF(Stemcell Technologies), StemPro MSC SFM XenoFree (Invitrogen), MSCGM-CD(Lonza)等等。這些培養(yǎng)基中會添加許多生長因子來代替血清的功能，常見的生長因子有：血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）、血小板衍生生長因子AB（PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、肝素結(jié)合表皮生長因子（HB-β）和胰島素生長因子-1(IGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）等等[27]。也有研究發(fā)現(xiàn)這些生長因子能促進MSC增殖的同時，也促進MSC的成骨/成脂/成軟骨分化，導(dǎo)致不能很好地維持MSC的干性[28, 29]。

同樣，化學(xué)成份限定培養(yǎng)基(CDM)也不完美。例如，StemPro MSC SFM（是第一個獲得FDA批準(zhǔn)的這種類型的商業(yè)產(chǎn)品）能促進MSC高表達II類MHC分子HLA-DR，即MSC的免疫原性增高，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對MSC的快速清除[30]。也有研究顯示化學(xué)成份限定培養(yǎng)基STK2能延緩培養(yǎng)過程出現(xiàn)的復(fù)制衰老，衰老的MSC明顯少于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基[31]。另外，本小編曾經(jīng)比較過不同公司的無血清培養(yǎng)對MSC功能的影響，初步發(fā)現(xiàn)Corning和Gibco的無血清培養(yǎng)基對MSC的免疫抑制功能沒有影響，而MACS、Lonza和R&D公司的無血清培養(yǎng)基均損傷了MSC的免疫抑制能力（見下圖）。

很多MSC培養(yǎng)基配方中喜歡添加地塞米松或同類激素，確實地塞米松能促進MSC的增殖，而且不同濃度的地塞米松對MSC分泌生長因子譜有差異，但是不同濃度的地塞米松均能損傷MSC的免疫[32]。所以，如果打算用MSC來治療免疫性疾病，那真的不建議用地塞米松來擴增MSC。除非能找到方法抵消地塞米松的這種副作用，只保留其促增殖作用。

2. 氧分壓

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的氧分壓約為1-7%[33-35]，而脂肪組織的氧分壓為10-15%[36]。骨髓腔血管外的氧分壓遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于動脈血管內(nèi)的氧分壓。因此，在生理上，MSC更適合低氧分壓環(huán)境。

MSC在低氧（0.5-3%）條件下培養(yǎng)，可通過促進低氧誘導(dǎo)因子（HIF1α）的高表達，激活抗凋亡基因Akt、Bcl2，從而提高MSC輸入后的存活能力[37-39]和上調(diào)趨化因子受體CXCR4、CX3CR1，增強MSC的歸巢能力[40, 41]。

低氧環(huán)境能不僅促進細(xì)胞增殖，還通過降低caspase-3的酶活性而起抗凋亡作用，并通過增加MSC表達多種生長因子，比如HIFα和HGF等，增強MSC在血管新生方面的功能[42]。

在缺氧條件下培養(yǎng)MSC可提高其增殖能力，并減少培養(yǎng)過程中的自發(fā)分化[43]。而且低氧培養(yǎng)MSC并不會對MSC的免疫抑制功能有影響[44]。

但是低氧培養(yǎng)的一個問題，是為了維持低氧的環(huán)境，氮氣的消耗會非?？?，培養(yǎng)成本和管理成本會相應(yīng)增加一些。

3. 培養(yǎng)載體

雖然有多種生物材料支持MSC的生長，MSC的增殖過程中和生物材料有信息交流（見下圖）。

但是MSC在不同硬度的材料上培養(yǎng)，MSC能感知材料的硬度，從而導(dǎo)致其細(xì)胞形狀和功能有所差異[45-47]。軟質(zhì)基質(zhì)上的MSC可促進傷口愈合；相反，硬質(zhì)基質(zhì)會降低MSC對傷口的愈合功能，促進瘢痕增生[48, 49]。MSC在微載體上模擬3D培養(yǎng)，也能促進MSC的增殖，而且還能增加MSC表達心臟標(biāo)志基因（Gata4、NKX2.5、Tnnt2和MYH6）[50]。

到目前為止，許多新的培養(yǎng)材料包括由膠原、糖胺聚糖、甲基丙烯酸透明質(zhì)酸、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯或海藻酸鹽制成的水凝膠，而且都可以制備成不同的硬度，以誘導(dǎo)MSC向某一特定方面培養(yǎng)[51, 52]。

聚-ε-己內(nèi)酯，一種生物相容性和生物可降解的材料，支持MSC的增殖，同時保持其分化能力和分泌生長因子的功能，而且在這些“微載體”上的細(xì)胞可以直接植入體內(nèi)，而不需要利用酶分離MSC和材料[53]。有趣的是，對溫度敏感的聚合物在水溶液中表現(xiàn)出可逆的溫度依賴性相變，這是一種獨特的特性，可通過外部溫度變化來控制MSC和聚合物材料的粘附和解離[54, 55]?；谡纤?肽結(jié)合的細(xì)胞粘附性、含肽的熱敏表面被設(shè)計成包含熱誘導(dǎo)的“開-關(guān)”，這種方法可以實現(xiàn)無胰蛋白酶消化MSC，基本上消除了酶介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[56]。

在這些生物材料的基礎(chǔ)上，MSC可以2D平面培養(yǎng)（最常見的培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿），也可以附著在微載體上3D培養(yǎng)，各有利弊，滿足不同的需求?？茖W(xué)研究，可以追求漂亮的花式花樣。產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，則量力而行，把握好利弊之間的平衡就好。

最后，用一張很好的圖來總結(jié)目前MSC的生產(chǎn)培養(yǎng)體系！