節(jié)選自：間充質(zhì)干細(xì)胞，本公號小編略作修整

作者：東海先生

基礎(chǔ)培養(yǎng)有DMEM、DF-12、αMEM、IMDM等。不同基礎(chǔ)培養(yǎng)對MSC大規(guī)模擴(kuò)增有沒有影響？目前這方面的研究極少。

胎牛血清（FBS）是研究實(shí)驗(yàn)室中最常見的培養(yǎng)補(bǔ)充液。有專家認(rèn)為胎牛血清有幾個(gè)劣勢：成本高、批次變異(產(chǎn)生于其1800種蛋白質(zhì)和4000種代謝物的不同濃度)、可用性有限(只有三分之一的胎牛血清產(chǎn)品符合細(xì)胞治療的監(jiān)管要求)、各種豬的病毒污染和以及引起異種免疫反應(yīng)的可能性等等問題[16-18]。因此，2019年的一篇綜述認(rèn)為FBS的使用可能被認(rèn)為不足以培養(yǎng)臨床應(yīng)用的MSCs[19]。

歐盟2013年有文件《Guideline on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products》規(guī)定胎牛血清供應(yīng)方需要提供安全性檢測，關(guān)鍵是不能污染了各種病毒（bluetongue and related orbiviruses、bovine adenovirus、bovine parvovirus、bovine respiratory syncytial virus、bovine viral diarrhoea virus、rabies virus、reovirus 3、bovine viraldiarrhoea virus、bovine polyoma virus等）。和歐盟的態(tài)度一樣，美國FDA并不反對胎牛血清的應(yīng)用。但FDA對胎牛血清的描述就沒有歐盟那么具體，只需要保證胎牛血清不能來自疫區(qū)，明確提及不能污染口蹄疫病毒和瘋牛病病毒。澳大利亞治療品管理局允許使用FBS生產(chǎn)臨床級材料，只要它來自澳大利亞或新西蘭等沒有瘋牛病疫情的國家的牛。

臨床對照實(shí)驗(yàn)顯示MSC臨床應(yīng)用的安全性，MSC治療不會(huì)增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，MSC治療組和對照組在惡液質(zhì)和成瘤方面沒有差異。Meta分析發(fā)現(xiàn)MSC治療與發(fā)燒存在一定的關(guān)聯(lián)性，而與其他文獻(xiàn)所報(bào)道的不良反應(yīng)沒有必要的聯(lián)系。那么發(fā)燒是否與培養(yǎng)基添加胎牛血清有關(guān)？有關(guān)聯(lián)，但是胎牛血清不是引起發(fā)燒的唯一因素。

劃重點(diǎn)：MSC治療不存在感染和致瘤風(fēng)險(xiǎn)

為了避免與FBS相關(guān)的不良并發(fā)癥，可使用替代動(dòng)物血清的培養(yǎng)基。最常用的是人AB血清(HABS)、人血小板裂解物(HPL)和化學(xué)限定培養(yǎng)基(CDM)。然而，這些替代方案依然存在自身的局限性。HABS和HPL均存在病毒（HIV、HBV、HCV、梅毒等）污染的可能性，而且不同批次之間有明顯的差異[20]。成人供者的HABS（血清）在保留MSC重要特性的情況下能否比FBS更能促進(jìn)MSC增殖的作用是有爭議的[21-23]。

比如美國波士頓的塔夫茨-新英格蘭醫(yī)療中心的研究員發(fā)現(xiàn)人HABS在促進(jìn)臍帶MSC增殖方面不如胎牛血清，而且HABS培養(yǎng)臍帶MSC容易成團(tuán)（見下圖）。 

人血小板裂解物(HPL)最近成為一種更受歡迎的人類產(chǎn)品，可以代替胎牛血清[22, 24]。血小板在冷凍/解凍過程中被激活，釋放多種生長因子，再通過離心以清除血小板小體。獲得的生長因子包括血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）、血小板衍生生長因子AB（PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、胰島素生長因子-1(IGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等[24, 25]，這些因子以劑量依賴的方式提高了MSC的增殖能力。添加5%的HPL的培養(yǎng)基在克隆形成效率和增殖能力方面優(yōu)于10%FBS，從而提供了更有效的MSCs擴(kuò)增[24]。

然而，一些研究顯示血小板裂解物的局限性，包括成骨或成脂分化能力降低[26]，以及表面標(biāo)志表達(dá)改變和降低MSC的免疫抑制能力[20]。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，從外周血中獲得的HPL含有促炎因子CCL3和CCL5，這些因子可能影響MSC的功能[20]。和胎牛血清培養(yǎng)MSC相比，HPL培養(yǎng)的MSC出現(xiàn)免疫抑制功能減弱的情況[20]。

化學(xué)限定培養(yǎng)基(CDM)因?yàn)椴缓?，能避免血清制品帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)，這些培養(yǎng)基中會(huì)添加許多生長因子來代替血清的功能。有研究發(fā)現(xiàn)這些生長因子能促進(jìn)MSC增殖的同時(shí)，也促進(jìn)MSC的成骨/成脂/成軟骨分化，導(dǎo)致不能很好地維持MSC的干性[28, 29]。

同樣，化學(xué)成份限定培養(yǎng)基(CDM)也不完美。例如，StemPro MSC SFM（是第一個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的這種類型的商業(yè)產(chǎn)品）能促進(jìn)MSC高表達(dá)II類MHC分子HLA-DR，即MSC的免疫原性增高，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對MSC的快速清除[30]。也有研究顯示化學(xué)成份限定培養(yǎng)基STK2能延緩培養(yǎng)過程出現(xiàn)的復(fù)制衰老，衰老的MSC明顯少于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基[31]。

另外，本小編曾經(jīng)比較過不同公司的無血清培養(yǎng)對MSC功能的影響，初步發(fā)現(xiàn)Corning和Gibco的無血清培養(yǎng)基對MSC的免疫抑制功能沒有影響，而MACS、Lonza和R&D公司的無血清培養(yǎng)基均損傷了MSC的免疫抑制能力（見下圖）。

劃重點(diǎn)：動(dòng)物血清培養(yǎng)基：存在成本高、批次差異、可用性有限及病毒感染等風(fēng)險(xiǎn)：化學(xué)培養(yǎng)基做出的細(xì)胞干性差、免疫抑制功能弱，機(jī)體免疫系統(tǒng)加速清除；

很多MSC培養(yǎng)基配方中喜歡添加地塞米松或同類激素，確實(shí)地塞米松能促進(jìn)MSC的增殖，而且不同濃度的地塞米松對MSC分泌生長因子譜有差異，但是不同濃度的地塞米松均能損傷MSC的免疫[32]。所以，如果打算用MSC來治療免疫性疾病，那真的不建議用地塞米松來擴(kuò)增MSC。除非能找到方法抵消地塞米松的這種副作用，只保留其促增殖作用。

劃重點(diǎn)：量足不代表作用一定好，不能簡單粗暴以數(shù)量評價(jià)一份細(xì)胞性價(jià)比。

氧分壓

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的氧分壓約為1-7%[33-35]，而脂肪組織的氧分壓為10-15%[36]。骨髓腔血管外的氧分壓遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于動(dòng)脈血管內(nèi)的氧分壓。因此，在生理上，MSC更適合低氧分壓環(huán)境。

MSC在低氧（0.5-3%）條件下培養(yǎng)，可通過促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子（HIF1α）的高表達(dá)，激活抗凋亡基因Akt、Bcl2，從而提高M(jìn)SC輸入后的存活能力[37-39]和上調(diào)趨化因子受體CXCR4、CX3CR1，增強(qiáng)MSC的歸巢能力[40, 41]。

低氧環(huán)境能不僅促進(jìn)細(xì)胞增殖，還通過降低caspase-3的酶活性而起抗凋亡作用，并通過增加MSC表達(dá)多種生長因子，比如HIFα和HGF等，增強(qiáng)MSC在血管新生方面的功能[42]。在缺氧條件下培養(yǎng)MSC可提高其增殖能力，并減少培養(yǎng)過程中的自發(fā)分化[43]。而且低氧培養(yǎng)MSC并不會(huì)對MSC的免疫抑制功能有影響[44]。

但是低氧培養(yǎng)的一個(gè)問題，是為了維持低氧的環(huán)境，氮?dú)獾南臅?huì)非?？欤?strong>培養(yǎng)成本和管理成本會(huì)相應(yīng)增加一些。

劃重點(diǎn)：“特種兵“都是在惡劣環(huán)境下培養(yǎng)“歷練“出來的，什么樣的外環(huán)境出什么樣的干細(xì)胞。當(dāng)然，培養(yǎng)精英人才是需要加大投入的。

培養(yǎng)載體

雖然有多種生物材料支持MSC的生長，MSC的增殖過程中和生物材料有信息交流（見下圖）。

MSC在不同硬度的材料上培養(yǎng)，能感知材料的硬度，從而導(dǎo)致其細(xì)胞形狀和功能有所差異[45-47]：

軟質(zhì)基質(zhì)上的MSC可促進(jìn)傷口愈合；

相反，硬質(zhì)基質(zhì)會(huì)降低MSC對傷口的愈合功能，促進(jìn)瘢痕增生[48, 49]。

MSC在微載體上模擬3D培養(yǎng)，也能促進(jìn)MSC的增殖，而且還能增加MSC表達(dá)心臟標(biāo)志基因（Gata4、NKX2.5、Tnnt2和MYH6）[50]。

到目前為止，許多新的培養(yǎng)材料包括由膠原、糖胺聚糖、甲基丙烯酸透明質(zhì)酸、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯或海藻酸鹽制成的水凝膠，而且都可以制備成不同的硬度，以誘導(dǎo)MSC向某一特定方面培養(yǎng)[51, 52]。

以下過于專業(yè)，如覺晦澀請略過。

聚-ε-己內(nèi)酯，一種生物相容性和生物可降解的材料，支持MSC的增殖，同時(shí)保持其分化能力和分泌生長因子的功能，而且在這些“微載體”上的細(xì)胞可以直接植入體內(nèi)，而不需要利用酶分離MSC和材料[53]。有趣的是，對溫度敏感的聚合物在水溶液中表現(xiàn)出可逆的溫度依賴性相變，這是一種獨(dú)特的特性，可通過外部溫度變化來控制MSC和聚合物材料的粘附和解離[54, 55]?；谡纤?肽結(jié)合的細(xì)胞粘附性、含肽的熱敏表面被設(shè)計(jì)成包含熱誘導(dǎo)的“開-關(guān)”，這種方法可以實(shí)現(xiàn)無胰蛋白酶消化MSC，基本上消除了酶介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[56]。

在這些生物材料的基礎(chǔ)上，MSC可以2D平面培養(yǎng)（最常見的培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿），也可以附著在微載體上3D培養(yǎng)，各有利弊，滿足不同的需求。

總之，科學(xué)研究，可以追求漂亮的花式花樣。產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，則量力而行，把握好利弊之間的平衡就好。