干細(xì)胞的制備與鑒定

小夢想在努力 2021-08-09

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干細(xì)胞的體外培養(yǎng)特性

與一些成熟細(xì)胞相比，干細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件要求相對苛刻，因?yàn)樗隗w外培養(yǎng)條件下容易自然分化而失去干細(xì)胞的基本特性。干細(xì)胞的體外培養(yǎng)難點(diǎn)是既要維持干細(xì)胞的“干性”，又要令其增殖而保持未分化狀態(tài)，這本身就是一對矛盾。由于不同來源的干細(xì)胞，其生長特性差異較大，體外培養(yǎng)條件也有一定差別，一般需要根據(jù)不同類型的干細(xì)胞建立相應(yīng)的個性化培養(yǎng)體系，特別是將某種干細(xì)胞建成細(xì)胞系，更需要建立穩(wěn)定的培養(yǎng)技術(shù)。體外制備干細(xì)胞包括干細(xì)胞或富含干細(xì)胞的材料采集、分離純化、擴(kuò)增、鑒定及儲存等過程，分離、培養(yǎng)過程需要在無菌層流實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，需要在培養(yǎng)體系中添加一些維持其“干性”和促進(jìn)增殖的因子。

胚胎干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)原始材料來源包括受精卵發(fā)育而來的桑葚胚、囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、胎兒生殖脊等。

體外制備包括以下過程：

①原始胚胎干細(xì)胞的獲?。?/span>采用機(jī)械法分離、胰酶或膠原酶消化獲得原始胚胎干細(xì)胞懸液。

②細(xì)胞傳代培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液接種在改良的Eargle培養(yǎng)液中培養(yǎng)2~3天，然后轉(zhuǎn)移到經(jīng)放射線照射或絲裂霉素處理的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。由于處理后的成纖維細(xì)胞失去了增殖能力，但還能分泌多種細(xì)胞因子，可維持胚胎干細(xì)胞的“干性”和促進(jìn)其增殖。飼養(yǎng)層細(xì)胞一般采用3T3、STO等小鼠細(xì)胞系，也可采用自制的胎鼠成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)體系中，一般還需要添加適當(dāng)濃度的胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、β-巰基乙醇、白血病抑制因子（LIF）、干細(xì)胞因子（SCF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等，其中LIF具有抑制胚胎干細(xì)胞分化的功能。為防止細(xì)菌污染，可按其他細(xì)胞培養(yǎng)體系的要求加入雙抗。胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)體系中呈克隆生長，待單個細(xì)胞長成集落后，挑取細(xì)胞集落，用低濃度的胰酶消化分散后，繼續(xù)用上述培養(yǎng)體系進(jìn)行傳代培養(yǎng)。經(jīng)反復(fù)傳代培養(yǎng)，可獲得高純度的生長旺盛的胚胎干細(xì)胞。如果撤除培養(yǎng)體系中的血清成分，胚胎干細(xì)胞會自動分化形成擬胚胎體，其中含有多種類型的組織細(xì)胞，說明血清中可能含有維持胚胎干細(xì)胞特性的因子。

③細(xì)胞鑒定：對細(xì)胞的生長特性、表型標(biāo)志、核型、細(xì)胞周期、分化潛能進(jìn)行分析鑒定。

④胚胎細(xì)胞儲存：將胚胎干細(xì)胞置于含有10%二甲基亞砜（MDOS）的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中，按常規(guī)方法程序降溫，最后置于-196℃液氮中長期保存。最近些年還開發(fā)出一些無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)證實(shí)干細(xì)胞在這些培養(yǎng)基中生長良好，避免了添加血清中攜帶病原的可能性，減少了胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)研究與應(yīng)用中的干擾因素，為臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?；?qū)牖蛐》肿踊衔锏日T導(dǎo)培養(yǎng)獲得的胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，其培養(yǎng)、擴(kuò)增條件與胚胎干細(xì)胞相似。優(yōu)化胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件，研究更為高效的培養(yǎng)基，特別是不含血清的培養(yǎng)基仍然是胚胎干細(xì)胞研究的重要方面。

成體干細(xì)胞的種類繁多，幾乎在所有組織中均發(fā)現(xiàn)有干細(xì)胞存在，不同組織來源的干細(xì)胞在數(shù)量、細(xì)胞形態(tài)、生長特性、表型標(biāo)志、分化條件及分化潛能上千差萬別，體外培養(yǎng)條件要求不盡一致，很難建立一套適用于所有成體干細(xì)胞培養(yǎng)的通用技術(shù)方案，需要針對不同類型的成體干細(xì)胞建立“個性化”體外制備技術(shù)。由于成體干細(xì)胞可以來源于自體，避免了免疫排斥和胚胎干細(xì)胞涉及的倫理及安全問題，在臨床上具有優(yōu)先應(yīng)用優(yōu)勢，因此在2000年以來受到高度重視，在體外制備技術(shù)方面取得了諸多突破性成果，極大地促進(jìn)了成體干細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

成體干細(xì)胞體外制備通常也包括材料采集、分離純化、體外擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化、儲存、復(fù)蘇等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。在采集獲得成體組織之后，根據(jù)組織來源及特性，分別采用機(jī)械分離、密度梯度離心、酶消化、免疫磁珠分離、流式細(xì)胞術(shù)分離等方法分離制備成單細(xì)胞懸液，然后將其置于特定的培養(yǎng)體系中進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)體系中一般也要加入維持“干性”和促進(jìn)其生長的細(xì)胞因子，例如干細(xì)胞因子（SCF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等。為進(jìn)一步純化干細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中根據(jù)干細(xì)胞的特性進(jìn)行貼壁培養(yǎng)、差速貼壁、克隆篩選、免疫吸附等辦法進(jìn)一步純化和去除雜細(xì)胞，例如利用間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的特性進(jìn)行貼壁培養(yǎng)可獲得骨髓、脂肪、臍帶等組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞，采用差速貼壁法可去除其中的少量成纖維細(xì)胞。

有一些成體干細(xì)胞可采用組織塊培養(yǎng)法獲得，方法是將組織剪碎成小于1mm3大小的組織塊，將其接種于培養(yǎng)瓶底，先加入少量培養(yǎng)液，待組織塊貼壁后再補(bǔ)充培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，其中的干細(xì)胞可沿組織塊周圍長出，然后去除組織塊并進(jìn)行傳代擴(kuò)增獲得大量干細(xì)胞。這種方法適用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等貼壁生長較快的干細(xì)胞，同一組織塊可進(jìn)行反復(fù)培養(yǎng)。骨髓、臍血組織中的造血干細(xì)胞一般采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁珠法可分離獲得純度大于99%的造血干細(xì)胞，但體外擴(kuò)增相對困難，一般要在半固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)基中需要添加血清、多種促進(jìn)其生長的因子。也有人認(rèn)為，在干細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加血小板生長因子可促進(jìn)干細(xì)胞生長，甚至可以取代血清添加。還有一些干細(xì)胞在體外培養(yǎng)體系中適于懸浮生長并形成懸浮細(xì)胞球，例如海馬神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)干細(xì)胞等?？傊?，成體干細(xì)胞的分離主要利用其生長特性進(jìn)行選擇性培養(yǎng)或依據(jù)相對特異的標(biāo)志性細(xì)胞表面抗原進(jìn)行免疫學(xué)篩選，體外擴(kuò)增則需要根據(jù)其生長特性建立不同的培養(yǎng)體系和技術(shù)方法，培養(yǎng)體系中需要添加促進(jìn)生長和維持“干性”的細(xì)胞因子，否則傳代培養(yǎng)后，干細(xì)胞會自動分化和老化而失去活性。

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干細(xì)胞的鑒定

主要依據(jù)其在形態(tài)特征、細(xì)胞成分與結(jié)構(gòu)、基因修飾與表達(dá)差異、生長特性、表型標(biāo)志、體內(nèi)外分化潛能等方面與成熟細(xì)胞的差異，分別采用光學(xué)顯微鏡觀察、電鏡觀察、免疫組織化學(xué)、組織病理觀察、流式細(xì)胞術(shù)、基因結(jié)構(gòu)與開放表達(dá)、表觀遺傳分析等技術(shù)，從不同側(cè)面建立干細(xì)胞的鑒定技術(shù)方法、指標(biāo)體系和標(biāo)準(zhǔn)。從概念上講，干細(xì)胞的最基本特征是自我更新能力和多向分化潛能，增殖能力是考察干細(xì)胞活性的重要依據(jù)，而在體內(nèi)外是否能夠向多種類型的成熟細(xì)胞分化則是認(rèn)定干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”。因此，胚胎干細(xì)胞重點(diǎn)分析其全能性，而成體干細(xì)胞則重點(diǎn)分析其是否能夠向2種以上不同組織類型的成熟細(xì)胞分化，特別是是否能夠分化為不同胚層的功能細(xì)胞。

體外長期培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞鑒定：

①形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：呈圓形或梭形，也有一些呈多角形，體積小，細(xì)胞核大，胞質(zhì)少，可見一個或多個細(xì)胞核，細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對簡單，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)除有大量游離的核糖體和線粒體外，其他細(xì)胞器很少。

②生長特性：小鼠的胚胎干細(xì)胞呈巢式或集落式生長，邊緣光滑，細(xì)胞排列緊密。人胚胎干細(xì)胞的克隆生長特點(diǎn)與恒河猴等靈長類動物的胚胎干細(xì)胞相似，細(xì)胞形態(tài)呈扁平，細(xì)胞之間呈緊密連接，易被胰酶消化，但靈長類動物的胚胎干細(xì)胞呈松散連接。

③表型標(biāo)志：胚胎干細(xì)胞表達(dá)胚胎階段特異性抗原（SSEA）和癌胚胎抗原（CEA），但表達(dá)模式具有種屬特異性。人和靈長類動物ES細(xì)胞表達(dá)SSEA-3、SSEA-4，不表達(dá)SSEA-1，人生殖脊干細(xì)胞（EG）則表達(dá)SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，小鼠以表達(dá)SSEA-1為主。胚胎干細(xì)胞高表達(dá)堿性磷酸酶，堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽性。還表達(dá)干細(xì)胞因子（stem cell factor）、生殖細(xì)胞核因子（germ cell nuclear factor）、轉(zhuǎn)錄因子 Oct3/4、端粒酶、高分子糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81、CD30、GCTM2、GenesisDG等。利用這些差異和表面標(biāo)志物，可以驗(yàn)證胚胎干細(xì)胞。

④體外分化能力：主要包括擬胚胎體的形成和定向分化潛能分析。從胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系中去除飼養(yǎng)層和分化抑制因子后繼續(xù)培養(yǎng)，可自動形成擬胚胎體，其中包含有內(nèi)外胚層的三微結(jié)構(gòu)團(tuán)塊。繼續(xù)培養(yǎng)還可以形成含有體腔的囊裝擬胚胎體，其中含有內(nèi)、中、外3個胚層的血管、神經(jīng)、肌肉、腺體、骨等微型組織和多種譜系的細(xì)胞。在撤除飼養(yǎng)層和分化抑制因子之后，向培養(yǎng)體系中添加特定的誘導(dǎo)因子，包括小分子化合物、生物活性因子或物理因素，均可誘導(dǎo)ES細(xì)特定類型的成熟細(xì)胞分化并表達(dá)相應(yīng)的特異性抗原標(biāo)志，具有相應(yīng)的細(xì)胞功能。

⑤體內(nèi)分化潛能：將ES細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠，如SCID鼠、裸鼠皮下后，可逐漸長成畸胎瘤，組織學(xué)觀察可見內(nèi)、中、外3個胚層的組織和細(xì)胞，對組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，可見多種類型的成熟細(xì)胞。將胚胎干細(xì)胞通過顯微注射技術(shù)注射到其他正在發(fā)育生長的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，可以培育出嵌合體動物，胚胎干細(xì)胞可隨胚胎發(fā)育進(jìn)入各種組織并向相應(yīng)類型的功能細(xì)胞分化，整合于組織之中并發(fā)揮功能，而且也可以分化為生殖細(xì)胞，具有生殖系傳遞功能。如果將胚胎干細(xì)胞定位移植到成體的特定組織中，它可以在組織微環(huán)境的誘導(dǎo)下“入鄉(xiāng)隨俗”，定向分化為所在組織類型的功能細(xì)胞，例如將胚胎干細(xì)胞移植到帕金森動物模型的紋狀體中可分化為能夠產(chǎn)生多巴胺和5-羥色胺的神經(jīng)元樣細(xì)胞，使帕金森癥狀改善。

成體干細(xì)胞的鑒定相對困難，因?yàn)槿狈μ禺愋缘目乖瓨?biāo)志物，生長特性和形態(tài)各異，分化潛能不如胚胎干細(xì)胞大。盡管在許多組織中存在干細(xì)胞，但由于其數(shù)量很少，且與組織中的其他細(xì)胞無明顯的差別，無法清楚地區(qū)分它們。因此，在各種不同的組織中如何科學(xué)地區(qū)分這些種類稀少的干細(xì)胞，或者如何發(fā)現(xiàn)一有效簡便的鑒別方法，是干細(xì)胞研究人員所必須解決的問題。過去人們普遍采用的鑒別干細(xì)胞的最基本且可靠的實(shí)驗(yàn)手段是利用干細(xì)胞最顯著的兩個特征，即慢周期性和自我更新能力，來鑒定在體與離體干細(xì)胞。由于干細(xì)胞的慢周期性，可采用標(biāo)記滯留細(xì)胞的分析方法識別在體的靜息干細(xì)胞。干細(xì)胞的自我更新能力在體外培養(yǎng)則表現(xiàn)為無限的增殖能力，形成細(xì)胞克隆，從而識別離體的干細(xì)胞。但這兩種方法應(yīng)用時具有一定的限制性。

主要鑒定方法：

①表型抗原標(biāo)志分析：目前研究人員普遍采用的方法是依靠干細(xì)胞的表面標(biāo)志來區(qū)分和鑒定各種干細(xì)胞，通過干細(xì)胞表面受體可以區(qū)分干細(xì)胞和其他細(xì)胞。成體組織來源的離體干細(xì)胞鑒定主要通過一系列陽性和陰性標(biāo)志的分析，綜合判定是否符合干細(xì)胞的表型。例如間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124、SH2、SH3等，而不表達(dá)造血干細(xì)CD106、CD124、SH2、SH3等，而不表達(dá)造血干細(xì)胞的抗原標(biāo)志物 CD34、CD14、CD45等。利用干細(xì)胞表面受體來鑒別干細(xì)胞有兩種方法，利用熒光素的化學(xué)特性和受體的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)相結(jié)合的方法來鑒別干細(xì)胞群。

②體外定向誘導(dǎo)分化：一些生物活性因子、化學(xué)物質(zhì)或組合因子可誘導(dǎo)成體干細(xì)胞定向分化，一些組織提取物也具有誘導(dǎo)成體干細(xì)胞定向分化的傾向，導(dǎo)入特定基因并令其高表達(dá)可穩(wěn)定誘導(dǎo)成體干細(xì)胞分化為某種類型的功能細(xì)胞。要驗(yàn)證成體干細(xì)胞是否具有多向分化潛能，至少應(yīng)考慮分化為3種以上不同組織類型的成熟細(xì)胞，選擇定向誘導(dǎo)分化為不同胚層細(xì)胞分化方向，例如臍帶、骨髓、脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定常定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、脂肪、骨、軟骨、肌肉等。

③體內(nèi)誘導(dǎo)分化：成體干細(xì)胞接種于免疫缺陷動物皮下一般難以形成包含多種組織類型細(xì)胞的組織，一般是定向注射于特定的組織中，觀察其是否可在組織微環(huán)境誘導(dǎo)下定向分化，例如注射入神經(jīng)、肌肉、肝、骨髓等組織中，通過體內(nèi)示蹤、免疫組織化學(xué)、表型變化、功能分析等方法驗(yàn)證其在體內(nèi)特定微環(huán)境中的分布和分化方向。對于單細(xì)胞生物和低等動物，可以很精確地通過其形態(tài)和定位而鑒別出其中的干細(xì)胞。例如在果蠅生殖腺和外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）中，干細(xì)胞和非干細(xì)胞的子代細(xì)胞對于其周圍細(xì)胞已具有很明確限定的方向。而在人和哺乳動物的許多組織中，干細(xì)胞的位置、微環(huán)境結(jié)構(gòu)尚不完全清楚，有些干細(xì)胞表面的分子標(biāo)志未完全得到確定，尋找成體干細(xì)胞的特異性標(biāo)志并為干細(xì)胞分離、鑒別提供新線索仍然是干細(xì)胞研究的重要方向。

隨著基因結(jié)構(gòu)、表觀遺傳和基因表達(dá)等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是大規(guī)模基因測序技術(shù)、表觀遺傳修飾分析及基因表達(dá)芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用，再加上大數(shù)據(jù)分析技術(shù)的不斷普及，干細(xì)胞鑒定越來越精準(zhǔn)、細(xì)致、全面。如利用生物芯片分析結(jié)合高通量基因測序技術(shù)分析干細(xì)胞相關(guān)基因的開放表達(dá)及表達(dá)譜分析干細(xì)胞的表型、功能，鑒別干細(xì)胞中特異性的基因和轉(zhuǎn)錄因子等。用PCR技術(shù)來鑒別具有活化的和導(dǎo)致細(xì)胞具有特性的基因的表達(dá)。這些技術(shù)有助于研究人員通過識別“基因標(biāo)志”來區(qū)分干細(xì)胞。例如：PDX-1基因是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，負(fù)責(zé)胰島素基因的最初活化，研究人員通過識別它來鑒別出能發(fā)育成胰島細(xì)胞的干細(xì)胞。還可利用基因工程技術(shù)結(jié)合熒光素技術(shù)而不依賴干細(xì)胞的表面標(biāo)志來鑒別干細(xì)胞，這種技術(shù)的重要性就在于允許人們檢測分化或定向分化時的干細(xì)胞。利用這種方法，可以進(jìn)行早期的干細(xì)胞分離，在組織中識別出它們或在分化的過程中追蹤它們。這些鑒別手段目前在許多實(shí)驗(yàn)室已被廣泛應(yīng)用，而且在未來的干細(xì)胞研究中將起主要作用，相信隨著對干細(xì)胞的研究日益深入，將會探索到更為準(zhǔn)確、省時的方法。

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干細(xì)胞的制備與鑒定