【原】基因編輯的原理和載體結(jié)構(gòu)

賽思基因 2022-05-11 發(fā)布于山東省

展開全文

基因編輯技術(shù)是指通過核酸酶對(duì)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)改造，實(shí)現(xiàn)特定DNA的定點(diǎn)敲除、敲入以及突變等，最終下調(diào)或上調(diào)基因的表達(dá)，以使動(dòng)植物、細(xì)胞等獲得新表型的一種新型技術(shù)。

目前基因編輯技術(shù)主要包括：（1）鋅指核酸酶技術(shù)(ZFN)；（2）轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)(TALEN)；（3）規(guī)律性間隔的短回文序列重復(fù)簇(CRISPR) 。?

鋅指核酸酶技術(shù)

1984年，科學(xué)家們?cè)诜侵拮傅霓D(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白，后來經(jīng)過人工改造并連接上核酸內(nèi)切酶后，發(fā)展為基因工程編輯工具：鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）。

工作原理：通過多個(gè)鋅指蛋白串聯(lián)起來形成一個(gè)鋅指蛋白組，從而識(shí)別一段特異的堿基序列，具有很強(qiáng)的特異性和可塑性，很適合用于設(shè)計(jì)鋅指核酸酶（ZFNs）。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內(nèi)切酶來自FokI的C端的96個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域。FokI是來自海床黃桿菌的一種限制性內(nèi)切酶，只在二聚體狀態(tài)時(shí)才有酶切活性，每個(gè)FokI單體與一個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN，識(shí)別特定的位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相距恰當(dāng)?shù)木嚯x時(shí)（6-8bp），兩個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能。從而達(dá)到DNA 定點(diǎn)剪切的目的。

轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)(TALEN)

2007年，德國科學(xué)家在植物黃單胞菌（Xanthomonas）中發(fā)現(xiàn)一種特殊的分泌蛋白質(zhì)—轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（Transcription activator-Like effector, TALE）該蛋白質(zhì)能夠結(jié)合植物宿主基因組并激活轉(zhuǎn)錄。2009年，TALE結(jié)合ＤＮＡ的機(jī)制被闡明。隨后在2012年，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物技術(shù)出現(xiàn)，并逐漸取代了鋅指核酸酶技術(shù)。

作用原理：與鋅指核酸酶技術(shù)相似，TLALEN也由兩部分組成，一部分是ＤＮＡ的特異性識(shí)別和結(jié)合區(qū)域—TALE，另一部分是與ZFN相同的ⅡＳ型的 Fok1核酸酶，通過二聚體化使目的片段產(chǎn)生雙鏈的斷裂。再通過激活細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制，利用NHEJ通路修復(fù)損傷，或者引入修復(fù)的ＤＮＡ模板，通過高保真的同源重組修復(fù)，來修復(fù)ＤＮＡ的雙鏈損傷。

CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)

1987年在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)29個(gè)核苷酸長度的重復(fù)序列中間被 32個(gè)核苷酸長度的非重復(fù)序列間隔開。2002年，Jansen等將這種微生物基因組中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)序列正式命名為CRISPR（Clusteren Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）。2012年Jinek等人，將分開作用的crRNA 和TracrRNA通過一段接頭連接在一起，形成一條單一指導(dǎo)RNA（single-guide RNA, sgRNA），這種RNA仍然能高效地介導(dǎo) Ｃａｓ９蛋白對(duì)DNA的定點(diǎn)切割，從而將CRISPR/Cas系統(tǒng)簡化為Cas9/sgRNA系統(tǒng)。

CRISPR的結(jié)構(gòu)及其工作原理：基因工程中常用的Cas核酸酶是Cas9核酸酶。它由1409個(gè)氨基酸組成，有２個(gè)重要的核酸酶結(jié)構(gòu)域（RuvC 和 HNH）。其中RuvC由３個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，RuvCⅠ靠近Cas9序列的Ｎ端，RuvC Ⅱ／Ⅲ位于ＨＮＨ結(jié)構(gòu)域靠近蛋白質(zhì)的中間的位置。HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)斷裂通過互補(bǔ)靶向的ＤＮＡ單鏈，切割位點(diǎn)位于PAM（Protospacer-adjacent motifs）序列上游3nt處。RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)斷裂另一條DNA鏈，切割位點(diǎn)位于PAM序列上游３～８nt處。

CRISPR/Cas9結(jié)構(gòu)

CRISPR

載體

上圖為CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)中常用的一種重組質(zhì)粒載體骨架。它主要包括下邊幾個(gè)部分：

1. ori（Origin of Replication）

ori是origin的縮寫，它是DNA序列上固定的復(fù)制起始點(diǎn)。ori對(duì)于宿主擴(kuò)增質(zhì)粒的能力至關(guān)重要，這也是為什么質(zhì)粒在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中方便易用的重要特征。

2. U6 promoter （U6 啟動(dòng)子）

啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游。U6啟動(dòng)子，屬于真核生物RNA聚合酶III，無物種特異性。

3. gRNA scaffold

gRNA scaffold sequence 是gRNA內(nèi)負(fù)責(zé)Cas結(jié)合的序列，不包括用于引導(dǎo)Cas9靶向DNA的20bp間隔/靶向序列。

4. CaMV enhancer（CaMV 增強(qiáng)子)

增強(qiáng)子是DNA上一段能與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。與蛋白質(zhì)結(jié)合后，基因的轉(zhuǎn)錄作用會(huì)增強(qiáng)。

5. Kozak sequence

Kozak 序列通常為ACCACCAUGG，位于起始密碼子AUG的兩側(cè)，通過與翻譯起始因子的結(jié)合而介導(dǎo)5'帽子-mRNA的翻譯起始。AUG后的G和-3位的A對(duì)翻譯起始至關(guān)重要，-15位~0位一般不含有T堿基。在真核表達(dá)載體中插入Kozak序列的目的一般是用來增強(qiáng)真核基因的翻譯效率。

6. 3× FLAG

三個(gè)串聯(lián)的FLAG表位標(biāo)簽，適用于基于抗體的親和純化。

7. eSpCas9（1.1）

Cas9核酸內(nèi)切酶，來源于化膿鏈球菌的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，經(jīng)過突變以提高靶向特異性。

8. nucleoplasmin NLS

核漿蛋白的二分核定位信號(hào)。

9. PuroR

一種抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Gene），能夠達(dá)到在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中篩選出攜帶有該質(zhì)粒的目的。本質(zhì)粒中的PuroR表達(dá)的是嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。即該質(zhì)粒能在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中篩選。

10.bGH poly(A) signal（bovine growth hormone polyadenylation signal，牛生長激素聚腺苷酸化信號(hào)）

bGH是真核生物mRNA3'端的加尾信號(hào)，用于轉(zhuǎn)錄終止，該信號(hào)終止較弱。常用的轉(zhuǎn)錄終止子還包括SV40、hGH、rbGlob等，終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)較強(qiáng)。

11. f1 ori（f1 bacteriophage origin）

f1噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)，其箭頭所指方向?yàn)殒満铣煞较颉?/span>

12. AmpR promoter

氨芐抗性基因的啟動(dòng)子

13. AmpR

氨芐抗性基因

END