CRISPR的熱度在分子生物界持續(xù)了數(shù)年，而2020年的諾貝爾化學獎授予給了兩位CRISPR的奠基者，更是將CRISPR的研究熱潮推上了頂峰。

CRISPR實際是（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，成簇的有規(guī)律的間隔短回文片段）的簡稱。 1987年，科學家在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一段“無法確定功能”的DNA，這段DNA中有一些小片段具有幾乎相同堿基排列方式，他們被一些排列方式多變的DNA隔開。當時, 科學家們并沒有意識到他們已經(jīng)探到了原核生物免疫秘密的邊緣。

后來，科學家們獲取了更多細菌基因組數(shù)據(jù)后，通過大量比較，鑒定出了位于CRISPR一側(cè)的Cas1-4四種基因。

隨著更深入的研究，科學家發(fā)現(xiàn)，CRISPR實際上與抵抗外來因子有關，細菌通過Cas蛋白獲得免疫。當病毒將自己的DNA注入細菌的時候，Cas識別PAM（protospacer-adjacentmotif, 原間隔序列毗鄰基序），接著就將其切割成小段，將前體間隔序列片段整合到CRISPR中，并遺傳給自己的后代。若后期或者后代再次遭遇同種DNA入侵的時候，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物便能識別入侵，并借助Cas基因表達的核酸酶清除入侵者的DNA。

利用這個發(fā)現(xiàn)，科學家改造CRISPR為基因編輯技術，改裝tracrRNA-crRNA，使它與Cas9結(jié)合，當他們進入細胞核并識別PAM序列后，會在其后方3個堿基的地方切斷DNA，并產(chǎn)生平末端切口。為了將編輯工具順利轉(zhuǎn)入細胞核，科學家探索出了在載體上插入核定位信號，以及電穿孔和利用病毒整合的方法。因為操作簡單，CRISPR/Cas9在幾年時間里成為分子生物學技術的熱門。

其實在CRISPR之前，早有ZFN、TALEN兩種基因編輯技術，而TALEN的特異性最高，是迄今商業(yè)化最成功的一項，今天的很多基因治療項目也是傾向于選擇TALEN的。那么，為什么不選擇CRISPR呢？

這就需要了解到CRISPR的脫靶效應。

由于sgRNA配對結(jié)合區(qū)域堿基有限，也許能夠配對的DNA片段在基因組里有數(shù)個，但如果把sgRNA的定位區(qū)設計過長，則有一部分會被剪掉，失去功能。并且在局部不配對的情況下，sgRNA的定位區(qū)也有可能與相似的DNA序列結(jié)合，導致切割錯誤的基因。sgRNA(crRNA)在靠近PAM的地方存在一段種子(seed)序列，如果種子序列發(fā)生任何錯配，就能導致靶點切割效率大跌甚至消失殆盡?；蚪M越龐大的生物越危險，尤其是擁有31.6億個堿基的人類。脫靶效應導致的后果，可能是錯誤的表型，更麻煩的可能是假表型——刪除了錯誤的基因，卻與刪除目標基因產(chǎn)生了相同的表型。所以sgRNA的設計優(yōu)化仍是一項長期工作。

今天，CRISPR在小鼠基因敲除上得到了應用，如果從這個方面與體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑比較，CRISPR依然存在周期長、失敗率較高，每只小鼠成本高出幾十倍的局限性。