IP / Denatured變性蛋白的免疫沉淀方法

Orange0ii2cj8q 2021-12-26

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變性蛋白的免疫沉淀方法 (IP / Denatured)

當?shù)鞍踪|處于正常天然構象時,某些抗體所識別的表位未能暴露出來,這種情況下需要采取下列方法進行變性蛋白的免疫沉淀.

A.所需溶液和試劑

注意：所有溶液均需要用Milli-Q超純水或是相當純度的其他水配制。

1. 變性細胞裂解液：50 mM Tris (pH 7.5), 70 mM β-巰基乙醇 (β-ME)。β-ME需新鮮加入，加入后先煮10分鐘。

2. 細胞裂解液 (1X): 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄，1μg /ml Leupeptin.

注意：使用之前加入1 mM PMSF。

3. 蛋白A瓊脂糖微球：取1.5 g 蛋白A瓊脂糖微球加入到5 ml的1X PBS中。4°C緩慢攪拌2小時。離心沉淀微球，用PBS清洗兩次。將微球重懸在1倍體積的PBS中。（處理后的微球可以在4°C存放2周）

4. 3X SDS上樣緩沖液：187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25°C), 6% w/v SDS, 30% 甘油, 150 mM DTT, 0.03% w/v溴酚藍。

B. 細胞裂解樣品制備

1. 吸去培養(yǎng)基。加入含調控因子的新鮮培養(yǎng)基，處理所需的時間。

2. 在非變性條件下收集細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗一次。

3. 棄去PBS，每個板（150 x 25 mm）中加0.4 ml變性細胞裂解液（使用前預煮10分鐘）。

4. 立即將所有細胞刮下，收集到2.5 ml的管中。

5. 沸水中煮10分鐘。

6. 加入4倍體積（1.6 ml）冰冷的1 X細胞裂解液。所得即細胞裂解物。如有必要，樣品裂解物可以保存在–80°C。

C. 免疫沉淀

1. 將一抗加入到200 μl細胞裂解物中，在4°C的轉子上孵育過夜。

2. 加入20 μl 50%漿狀的蛋白A瓊脂糖微球。在4°C的轉子上孵育1~3個小時。

3. 4°C離心30秒。沉淀用500 μl細胞裂解液洗五次，洗完置于冰上。

4. 將沉淀用20 μl 3X SDS上樣緩沖液重懸沉淀。渦旋震蕩，離心30秒。

5. 把樣品放在95–100°C加熱2-5分鐘。

6. 取15-30 μl樣品，上樣到SDS-PAGE膠（12–15%）上。

7. Western免疫印跡分析檢測（參考 Western Immunoblotting方法）。

天然蛋白的免疫沉淀方法(IP / Native Protein)

本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于western免疫印跡或是激酶活性分析

A. 所需溶液和試劑

注意：所有溶液用反滲透去離子水（Reverse Osmosis Deionized water, RODI）或相當純度的水配制。

1. 20 X 磷酸鹽緩沖生理鹽水 （PBS）: (#9808) 配制1L 1 X PBS時，取50 ml 20 X PBS用950 ml RODI水稀釋到1L，混勻。

2. 10 X 細胞裂解液: (#9803) 配制1 L 1 X細胞裂解液時，取100 ml 細胞裂解液加950 ml RODI水稀釋到1L，混勻。注意：使用前添加1 mM PMSF。

3. 藍色上樣緩沖液（SDS上樣緩沖液）：（#7722）。配制新鮮的3 X還原性SDS上樣緩沖液，在3X SDS上樣緩沖液中加入十分之一的30X的還原劑（1.25M）。

4. 蛋白A或G瓊脂糖微球（用于未標記的一抗）：（處理后可以在4°C保存2星期）。按照產品說明處理。蛋白A用于兔IgG抗體的沉淀，蛋白G用于小鼠IgG抗體的沉淀。

5. 固定有抗生物素蛋白Streptavidin的微球（用于生物素標記的抗體）: (#3419) 用前稍加震蕩，每個免疫下拉反應用10 μl。

6. 10X 激酶緩沖液:（#9802）配制1 ml 1X激酶緩沖液時，取100 μl 10 X激酶緩沖液用900 μl RODI水稀釋到1ml，混勻。

7. ATP (10 mM): （#9804）配制0.5 ml 200 μM ATP時，取10 μl ATP（10 mM）加入到490 μl 1X 激酶緩沖液中。

B. Preparing Cell Lysates細胞裂解物制備

1. 吸去培養(yǎng)基。加入含調節(jié)因子的新鮮培養(yǎng)基，處理所需的時間。

2. 在非變性條件下收集細胞，去掉培養(yǎng)基，用冰PBS清洗一次。

3. 去掉PBS，每個板（10cm）中加0.5 ml冰預冷的1 X細胞裂解液，在冰上孵育5分鐘。

4. 將所有細胞刮下，收集到一個離心管中。置于冰上。

5. 冰浴中對樣品用超聲處理3次，每次5秒鐘。

6. 4°C，14000 X g離心10分鐘。將上清轉移到新的離心管中，即為細胞裂解物。如有需要，樣品可以保存在-80°C。

C. 免疫沉淀

細胞裂解物預處理（對于未標記或生物素標記抗體而言是可選步驟）

1. 取200 μl 1 mg/ml的細胞裂解物，在其中加入10–30 μl 50%的蛋白A或G瓊脂糖微球漿（用于未標記的一抗）或10 μl抗生物素鏈菌素微球（用于生物素標記的抗體）

2. 4°C孵育30-60分鐘。

3. 4°C離心10分鐘。將上清轉移到新的管中。

4. 根據(jù)所用一抗選擇下面合適的操作步驟進行實驗。

使用未標記一抗

1. 14,000 X g離心1分鐘。取200 μl 1mg/ml的細胞裂解物，加入一抗。在4°C轉子上孵育過夜。

2. 加入蛋白A或G瓊脂糖微球（10-30 μl 50% 微球漿）。4°C轉子上孵育1-3個小時。

3. 4°C離心30秒。沉淀用500 μl 1 X細胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

4. 取沉淀進行Western免疫印跡分析或是激酶活性分析（見下文）。

使用生物素標記的一抗

1. 14,000 X g離心1分鐘。取200 μl 1mg/ml的細胞裂解物，加入生物素標記的一抗。在4°C轉子上孵育過夜。

2. 稍加震蕩。加入固定化抗生物素鏈菌素（與微球偶聯(lián)）（#3419）（10μl）。在4°C轉子上孵育2小時。

3. 4°C離心30秒。沉淀用500 μl 1 X細胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

4. 取沉淀進行Western免疫印跡分析或是激酶活性分析（見下文）。

使用固定化抗體（與微球偶聯(lián)）

1. 14,000 X g離心1分鐘。取200 μl 1mg/ml的細胞裂解物，加入固定化抗體10 μl。在4°C轉子上孵育過夜。

2. 4°C離心30秒。沉淀用500 μl 1 X細胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

3. 取沉淀進行Western免疫印跡分析或是激酶活性分析（見下文）。

D. 樣品分析

繼續(xù)下述任一種操作：

Western免疫印跡分析

1. 將沉淀用20 μl 3X SDS上樣緩沖液重懸。震蕩后離心30秒。

2. 把樣品放在95–100°C加熱2-5分鐘。14,000 X g離心1分鐘。

3. 取樣15-30 μl加到SDS-PAGE膠（4–20%）上。

4. Western 免疫印跡分析檢測（參考 Western Immunoblotting方法）。

注意：對于分子量約為50 kDa的蛋白，我們推薦使用小鼠抗兔IgG（輕鏈特異）（L57A3）mAb #3677或小鼠抗兔 IgG（構象特異）（L27A9）mAb #3678作為二抗，以減少變性重鏈產生的遮蔽作用。對于分子量接近25 kDa的蛋白，推薦使用小鼠抗兔IgG（構象特異）（L27A9）mAb #3678。

激酶活性分析

1. 沉淀用500 μl 1X激酶緩沖液清洗2次。置于冰上。

2. 將沉淀用添加有200 μM ATP和底物的40 μl 1X激酶緩沖液重懸沉淀。

3. 30°C孵育30分鐘。

4. 加入20 μl 3X SDS上樣緩沖液終止反應。震蕩后離心30秒。

5. 將含有磷酸化底物的上清轉移到新的管中。

6. 把樣品放在95–100°C加熱2-5分鐘。14,000 X g離心1分鐘。

7. 取樣15-30 μl加到SDS-PAGE膠（4–20%）上。

IP濃縮的檢測和定量

1. 定量的方法（標準PCR，定量PCR，CHIP-on-chip，CHIP測序）。

2. PCR的循環(huán)數(shù)和目的DNA位點的檢測。

3. 2%的總DNA經過一系列的連續(xù)稀釋后，是否進行了PCR分析（在G部分，步驟1有描述）？