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免疫共沉淀（Co-IP）是用于發(fā)現(xiàn)蛋白復(fù)合體及蛋白相互作用很好的工具，當(dāng)然這個技術(shù)在應(yīng)用時會遇到一些挑戰(zhàn)。下方是使用SureBeads磁珠得到的真實的Co-IP實驗結(jié)果。我們總結(jié)了6條非常有用的技巧和操作步驟幫助您獲得同樣成功的結(jié)果。  成功的IP和Co-IP結(jié)果。使用SureBeads IP操作步驟和cdc2抗體將HEK293細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，Cyclin B1蛋白成功地被免疫共沉淀下來。 Tips  1、樣品 - 選擇包含目標(biāo)蛋白復(fù)合物的生物學(xué)相關(guān)的樣本 - 避免過高蛋白濃度、劇烈的去垢劑如SDS或其它引起復(fù)合體解離的添加物  2、免疫沉淀 - 選擇新鮮制備的裂解液以便維持復(fù)合體 - 根據(jù)IP抗體種屬選擇磁珠, Protein A對兔IgGs有更高的親和力，Protein G對小鼠IgGs有更高的親和力  3、單向免疫共沉淀 - 由于蛋白豐度不同，你可能會觀察到單向Co-IP而不是雙向都能互相共沉淀。因此，選擇那個與其它組分結(jié)合占其總量比例高的組分作為免疫沉淀對象。  4、嘗試不同的抗體 - 如果沒有觀察到Co-IP可嘗試換抗體。如果捕獲抗體的抗原決定簇與蛋白相互作用的位點重合，則只有游離的蛋白被沉淀下來。  5、陽性和陰性對照 - 確定IP成功，需包含一個對照顯示出免疫沉淀的組分（陽性對照） - 確定Co-IP成功，需包含一個只加入SureBeads磁珠或IgGs的陰性對照  6、檢測分析 - 為了避免在Western中檢測出IP捕獲抗體，使用與IP抗體種屬來源不同的WB一抗。 SureBeads磁珠Co-IP實驗步驟 ▌ 樣品制備（以細(xì)胞為例） 1. 挑選適合目標(biāo)蛋白研究的細(xì)胞類型 2. 培養(yǎng)至3.6 x 107個細(xì)胞（約80 – 95%覆蓋滿T-175培養(yǎng)瓶） 3. 收獲前24-48小時進(jìn)行細(xì)胞傳代 4. 培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞至對數(shù)生長中期（觀察細(xì)胞密度） 5. 使用裂解液裂解細(xì)胞  6. 使用新鮮制備的裂解液進(jìn)行IP實驗 7. 使用SureBeads磁珠操作 ▌ 免疫共沉淀 1. 根據(jù)IP抗體種屬選擇Protein A或G 2. 震蕩混勻Surebeads磁珠將其懸浮，加入20 – 100 μl磁珠至管中 3. 吸附磁珠去除上清 4. 使用1ml PBST（1XPBS +0.1%Tween-20）清洗3次 5. 加入7.5 μg抗體常溫?fù)u轉(zhuǎn)孵育20分鐘 6. 使用1ml PBST清洗3次 7. 加入1mg蛋白裂解液，室溫?fù)u轉(zhuǎn)孵育1小時 8. 吸附磁珠，使用1ml PBST清洗3次 9. 加入20 μl 2XLaemmli即電泳上樣緩沖液, 90℃孵育5分鐘后進(jìn)行洗脫 10. 吸附磁珠，轉(zhuǎn)移上清至新管中 11. 再加入20 μl 2XLaemmli即電泳上樣緩沖液, 90℃孵育5分鐘后進(jìn)行洗脫 12. 吸附磁珠，轉(zhuǎn)移上清至同一個新管中 13. 電泳分析管中收集的IP樣品 備注： 磁珠體積、樣品量和IP抗體量可根據(jù)結(jié)果適當(dāng)進(jìn)行優(yōu)化。  SureBeads磁力架和磁珠 訂購信息  |
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