免疫共沉淀（Co-IP）是利用抗原與抗體之間的專一性作用為基礎(chǔ)，用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法。利用免疫共沉淀可以檢測(cè)兩個(gè)已知蛋白之間的相互作用，或者利用已知蛋白尋找與之相互作用的未知蛋白。相較于其他分子間相互作用檢測(cè)方法（GST pull down等），免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于蛋白的結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)完成，能夠反應(yīng)天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)相互作用，結(jié)果更加真實(shí)可靠。

實(shí)驗(yàn)原理

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用被保留了下來(lái)，假如細(xì)胞內(nèi)存在XY蛋白復(fù)合物，用X（X也稱為誘餌蛋白）的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y（Y也稱為靶蛋白）也被沉淀下來(lái)。因此在細(xì)胞裂解液中加入X的抗體沉淀蛋白X，隨后利用蛋白印跡（western blot，WB）檢測(cè)沉淀中是否存在蛋白Y，如果存在，則說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)存在XY蛋白復(fù)合物，即蛋白XY存在相互作用。

Co-IP實(shí)驗(yàn)流程

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)流程為：收集蛋白樣品—誘餌蛋白抗體沉淀誘餌蛋白—SDS-PAGE分離蛋白—WB檢測(cè)是否存在靶蛋白。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)操作流程請(qǐng)至“免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)操作流程及注意事項(xiàng)”查看。

收集蛋白樣品

蛋白樣品通常通過(guò)裂解細(xì)胞得到。Co-IP實(shí)驗(yàn)通常有兩種，一種為內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證，另外一種為非內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證，內(nèi)源性相互作用是指兩蛋白相互作用在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，即通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式將兩種蛋白轉(zhuǎn)染至同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)完成后收集細(xì)胞進(jìn)行裂解得到蛋白樣品。非內(nèi)源性相互作用兩蛋白相互作用在細(xì)胞外發(fā)生，即將含有靶蛋白的動(dòng)植物組織、器官進(jìn)行預(yù)處理及細(xì)胞裂解獲得細(xì)胞裂解液，隨后將誘餌蛋白（通常為重組表達(dá)純化獲得）加入細(xì)胞裂解液中，得到蛋白樣品。

沉淀誘餌蛋白

利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白：在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體，抗體會(huì)與誘餌蛋白結(jié)合，利用磁鐵將磁珠拉下，同時(shí)誘餌蛋白會(huì)一起被沉淀出來(lái)。如果存在與誘餌蛋白的相互作用的靶蛋白，也會(huì)被沉淀下來(lái)。如果沒(méi)有誘餌蛋白的特異性抗體，可以給誘餌蛋白加上標(biāo)簽（Myc、HA、Flag等），然后利用標(biāo)簽抗體沉淀蛋白。

SDS-PAGE及WB檢測(cè)

得到沉淀后，需要驗(yàn)證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復(fù)合物分離，隨后利用WB檢測(cè)是否存在靶蛋白（如果靶蛋白的分子量是已知的，可以直接用SDS-PAGE檢測(cè)是否存在靶蛋白）。

實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置

為了確保最終得到的結(jié)果是天然狀態(tài)下的相互作用，而不是由于某些方面造成的人工相互作用（也就是“假陽(yáng)性”），在Co-IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中，需要設(shè)置正確的對(duì)照。
假設(shè)Co-IP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”，則可能出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”及對(duì)應(yīng)需要設(shè)置的實(shí)驗(yàn)對(duì)照如下表所示：

上述為了避免出現(xiàn)“假陽(yáng)性”的對(duì)照稱為陰性對(duì)照，除此之外Co-IP實(shí)驗(yàn)還會(huì)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組（Input組），Input組為直接利用抗體X（抗體Y）對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB檢測(cè)，驗(yàn)證細(xì)胞裂解液中存在蛋白X（抗體Y）。
在某些Co-IP實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)人員會(huì)把IP后的上清分別進(jìn)行蛋白X和蛋白Y的WB檢測(cè)，該對(duì)照組稱為output組。
利用內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否存在已知作用，如果最終的結(jié)果為陽(yáng)性，則可以證明兩個(gè)蛋白之間存在相互作用；但如果結(jié)果為陰性，無(wú)法證明兩個(gè)蛋白之間不存在相互作用，也有可能是蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量低等原因?qū)е?。因此在進(jìn)行內(nèi)源性Co-IP驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否存在相互作用時(shí)，建議先做過(guò)表達(dá)Co-IP作為對(duì)照。

免疫共沉淀結(jié)果真實(shí)性

在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

• 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、可大量生產(chǎn)、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生；

• 要確?？贵w的特異性，如果抗體不能和細(xì)胞溶解物中的抗原結(jié)合，則不會(huì)引起共沉淀反應(yīng);

• 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的。

免疫共沉淀技術(shù)應(yīng)用

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)可以用于：

• 測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合

• 確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔

• 分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物

隨著對(duì)蛋白質(zhì)研究的不斷深入，人們將免疫沉淀方法與其他方法結(jié)合起來(lái)，在其基礎(chǔ)上衍生出許多較為復(fù)雜的技術(shù)，從而使得分析方法更為多樣化，它的應(yīng)用范圍也相當(dāng)?shù)膹V泛。免疫共沉淀是用來(lái)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的一種技術(shù)，可以應(yīng)用于蛋白復(fù)合物的研究。它可驗(yàn)證蛋白復(fù)合物的存在，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的蛋白復(fù)合物；免疫共沉淀技術(shù)與免疫印跡法或質(zhì)譜等方法結(jié)合，用于確定誘餌蛋白-目的蛋白在天然狀態(tài)下的結(jié)合情況，確定特定蛋白質(zhì)的新作用搭檔。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也可以應(yīng)用于低豐度蛋白的富集和濃縮。
同時(shí)免疫共沉淀技術(shù)是一個(gè)相對(duì)比較經(jīng)典的探討蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用范圍廣泛且可信度較高。蛋白質(zhì)之間相互作用滲透于機(jī)體每一個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中，生物學(xué)中會(huì)出現(xiàn)很多現(xiàn)象如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切、分泌、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)和中間代謝等都受到蛋白質(zhì)間相互作用的調(diào)控。有些蛋白質(zhì)由多個(gè)亞單位組成，蛋白質(zhì)之間的相互作用就顯得尤為普遍。又有些蛋白質(zhì)結(jié)合得十分緊密；而有些蛋白質(zhì)卻只有短暫的相互作用。可是不論出現(xiàn)哪些種情況，它們都控制著大量的細(xì)胞生命活動(dòng)的事件，比如細(xì)胞的增殖、分化和死亡。且通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用，能改變細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)特征，比如底物結(jié)合特性、催化活性，也可以產(chǎn)生新的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)改變蛋白質(zhì)對(duì)底物的特異性有作用，還可以使其他蛋白質(zhì)失活，其他基因表達(dá)得到調(diào)控。因此，只有讓蛋白質(zhì)之間相互作用得以順利進(jìn)行，細(xì)胞的正常生命活動(dòng)過(guò)程才會(huì)得到保障。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)之間相互作用具有如此重大的意義，所以它的檢測(cè)方法的研究也備受關(guān)注與重視。自此以后蛋白相互關(guān)系的研究會(huì)愈演愈烈，未來(lái)不僅僅可以通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)來(lái)證實(shí)，還將會(huì)有越來(lái)越多的先進(jìn)技術(shù)值得去應(yīng)用和發(fā)展。