為了建立慢性胚胎缺氧模型，將妊娠小鼠于妊娠期第14.5至18.5天暴露在10%O2中（Fig.1a）。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧組母鼠在整個(gè)妊娠期間的攝食量比常氧組減少了8.6%（Fig.1b），建立Cc組以排除研究結(jié)果可能不是由于缺氧，而是由于攝入的卡路里減少的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧組的E18.5胚胎表現(xiàn)出低出生體重，而Cc組沒有（Fig.1d）。另外通過評(píng)估經(jīng)典的缺氧誘導(dǎo)靶基因EPO在胚胎肝臟樣本中的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)它的轉(zhuǎn)錄在缺氧組中幾乎是對(duì)照組的四倍，從而證實(shí)了慢性缺氧確實(shí)激活了胎兒中HIF靶基因的轉(zhuǎn)錄。

跟蹤低氧和常氧組的產(chǎn)仔數(shù)顯示，每窩產(chǎn)仔數(shù)是相當(dāng)?shù)?，并且在整個(gè)哺乳階段保持不變，且在生存評(píng)估中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差別（Fig.1f），但發(fā)現(xiàn)后代出生后在性別、基因型和實(shí)驗(yàn)方面存在顯著差異，包括明顯的低氧組幼崽的追趕生長(zhǎng)（Fig.1g）。

使用基因陣列檢測(cè)缺氧胚胎腎臟的全基因組表達(dá)，與兩個(gè)對(duì)照組相比，有62個(gè)上調(diào)基因和28個(gè)下調(diào)基因（Fig.2a） ，其中有超過20%的上調(diào)基因經(jīng)常從鈣蛋白顆粒(CPPs)中純化出來，包括CPP的主要成分fetuin-A(Ahsg)等。

通過選擇基因的RT-qPCR驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)證實(shí)，只有在缺氧胚胎腎臟中有四倍以上的誘導(dǎo)，但在肝臟和對(duì)照組腎臟中沒有上調(diào)（Fig.2b-c）。上調(diào)率最高的基因Ahsg(>10倍)屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑的半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族，編碼陰性的急性時(shí)相糖蛋白胎球蛋白-A，其主要功能與礦化基質(zhì)代謝有關(guān)。

雖然Ahsg在低氧胎腎中顯著上調(diào)，但其血清胎球蛋白-A水平并沒有比對(duì)照組顯著升高（Fig.2d-e）。這是因?yàn)樵谡Ｇ闆r下，肝臟是循環(huán)Fetuin-A的主要來源(比胚胎腎臟高600倍)，而胚胎低氧模型中腎臟局部的“異位”胎球蛋白-A表達(dá)水平仍然比肝臟低60倍。這證明在缺氧的胚胎腎臟中誘導(dǎo)胎球蛋白-A不具有系統(tǒng)功能相關(guān)性，而是對(duì)發(fā)育中的腎臟具有局部的、重要的保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步解決胚胎缺氧腎臟中Ahsg表達(dá)的功能相關(guān)性，因此對(duì)它的精確定位進(jìn)行確定。

整體原位雜交顯示，胎球蛋白-A mRNA在缺氧胚胎腎臟皮質(zhì)區(qū)域合成，但在正常缺氧腎臟中不合成(補(bǔ)充圖4a-b)。胎球蛋白-A免疫熒光染色將其更精確地定位于外腎皮質(zhì)，恰好在腎區(qū)下方(補(bǔ)充圖4c)。免疫組化顯示在胚胎腎近端小管(PT)(Fig.3a，c，e，g)或小管腔(Fig.3b，d，f，h)。通過各種方法以及胎球蛋白-A和不同腎段標(biāo)志物的雙重免疫熒光染色(Fig.3i-x)證實(shí)胎球蛋白-A僅在缺氧胎腎的甲狀旁腺中表達(dá)。

通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)確認(rèn)胎球蛋白-A是一個(gè)進(jìn)化保守的依賴于缺氧誘導(dǎo)因子的靶基因（Fig.4a-b）。

此外，缺氧不僅促進(jìn)胎球蛋白-A的表達(dá)，而且還刺激了幾個(gè)纖維化標(biāo)志基因在原代小鼠PT細(xì)胞(Fig.4c)、胚胎腎臟(Fig.4d)和胚胎肺和心臟的表達(dá)。

測(cè)定成年野生型(Wt)和胎球蛋白-A(Ahsg)KO小鼠(Fig.5a-b)的尿蛋白水平和腎小球?yàn)V過率(GFR)顯示與對(duì)照組相比，9周齡的Ahsg KO動(dòng)物和胚胎期缺氧的小鼠的GFR降低，而蛋白尿嚴(yán)重增加。對(duì)纖維組織重塑的評(píng)估顯示在低氧條件下的Ahsg KO小鼠的腎臟中膠原蛋白表達(dá)水平最高(Fig.5c-e)，在組織學(xué)檢查中有多個(gè)膠原束延伸到更深的皮質(zhì)下區(qū)域(Fig.5f-i)。這些結(jié)果表明，Ahsg KO小鼠的腎功能受到的影響最大，表現(xiàn)出缺氧和胎蛋白A功能的相加效應(yīng)。

用新鮮分離的原代小鼠PT細(xì)胞（pPTCs）進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加胎球蛋白-A可以鈍化缺氧誘導(dǎo)的纖維化標(biāo)志物基因表達(dá)水平的增加（Fig.6a-d），在蛋白質(zhì)水平上也觀察到了這種減弱效應(yīng)(Fig.6e)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1（Tgfb1）是一種有效的纖維化誘導(dǎo)劑(Fig.6f)；用重組Tgfb1-Smad1刺激pPTCs后，其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Smad3被強(qiáng)烈磷酸化(Fig.6g)，與wt細(xì)胞相比，Ahsg KO pPTCs中的這種激活是wt細(xì)胞的三倍多(Fig.6h)，表明Ahsg KO細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的反應(yīng)更強(qiáng)烈。這些結(jié)果提示胎球蛋白-A通過直接拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1信號(hào)來減輕缺氧引起的腎纖維化。

巨噬細(xì)胞是引起腎損傷的另一種重要細(xì)胞類型，根據(jù)其極化程度進(jìn)一步分為促炎M1細(xì)胞或抗炎M2細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀對(duì)E18.5缺氧性或常氧性胎腎的巨噬細(xì)胞群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)雖然大多數(shù)巨噬細(xì)胞在正常缺氧的腎臟中是M2極化的(CD206+)，但從缺氧腎臟分離的大多數(shù)巨噬細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了M1的促炎表型，且M1極化巨噬細(xì)胞的比例在缺氧的Ahsg KO樣本中更為突出(Fig. 7)。

這表明缺氧促進(jìn)了促炎癥的M1巨噬細(xì)胞(CD206?)在腎臟的浸潤(rùn)和極化，提示胎球蛋白-A與整體抗炎環(huán)境有關(guān)。

缺氧性Ahsg KO腎臟炎癥表型增強(qiáng)的一個(gè)原因可能是腎臟鈣化，因?yàn)樘デ虻鞍?A KO小鼠容易軟組織鈣化。通過將新鮮切開的E18.5胚胎的腎臟切片與ATTO 488熒光標(biāo)記的胎球蛋白-A(488-FA)孵育來探索含鈣微粒的存在。488-FA染色顯示常氧大鼠腎臟的PT強(qiáng)烈標(biāo)記，這是一個(gè)主要的鈣吸收部位（Fig.8a)，PT染色強(qiáng)度在低氧WT中降低，在低氧Ahsg KO中增加(Fig.8b-c)。只有缺氧的Ahsg KO腎臟在乳頭區(qū)也顯示顆粒狀染色，在外皮層的腎生生區(qū)較少見(Fig.8f，I中的箭頭)，表明在沒有內(nèi)源性胎球蛋白-A的情況下有大量的礦物質(zhì)沉積。這些數(shù)據(jù)說明了胎球蛋白-A在腎臟礦化基質(zhì)結(jié)合和清除中的作用。

使用小鼠缺血再灌注損傷(IRI)45模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)IRI腎臟的組織損傷與含鈣微粒的沉積有關(guān)(Fig.8k)，這在對(duì)照組中沒有發(fā)現(xiàn)(Fig.8j)，此外，在IRI手術(shù)后每天服用胎球蛋白-A 4天，與生理鹽水治療的小鼠相比，其Col1a1和Col3a1的表達(dá)顯著減少(Fig.8l，m)。

這些證據(jù)表明，在損傷時(shí)補(bǔ)充胎球蛋白-A可能是一種很有前途的治療方法，可以對(duì)抗缺氧誘導(dǎo)的礦物質(zhì)應(yīng)激和纖維組織重塑，特別是在與胎球蛋白-A耗竭相關(guān)的情況下，如慢性腎臟病或急性炎癥。

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