2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的三位得主William G. Kaelin, Jr.、Gregg L. Semenza和Sir Peter J. Ratcliffe早在2016年就以細(xì)胞對(duì)低氧感知與適應(yīng)機(jī)制的研究斬獲了諾獎(jiǎng)風(fēng)向標(biāo)——拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，所以也沒(méi)有讓人特別意外。三人發(fā)現(xiàn)和鑒定的關(guān)鍵分子低氧誘導(dǎo)因子1 （hypoxia-inducible factor 1, HIF-1）。今天我們希望回到這一項(xiàng)研究的起點(diǎn)——促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，縮寫EPO），一個(gè)神奇的分子。

它，是紅細(xì)胞生成的最重要因素

紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，是脊椎動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)血液運(yùn)送氧氣和二氧化碳的最主要媒介。紅細(xì)胞在骨髓中生成：造血干細(xì)胞首先增殖分化為各類血細(xì)胞的祖細(xì)胞，其中紅系祖細(xì)胞能夠進(jìn)一步分化成熟為紅細(xì)胞。正常情況下人類的紅細(xì)胞生成速率很低，但在出血、溶血以及缺氧等脅迫壓力下，紅細(xì)胞的生成速率甚至可以提高8倍。在這一過(guò)程中，促紅細(xì)胞生成素EPO是最重要的因素，沒(méi)有之一。

EPO是一種主要在腎臟合成的激素，化學(xué)本質(zhì)是一種有高度糖基化修飾的蛋白質(zhì)。為什么是在腎臟？每分鐘有1升左右的血液流經(jīng)腎臟，所以腎臟能夠快速有效地監(jiān)測(cè)到血液中氧含量的變化。當(dāng)血液中氧含量較低時(shí)，腎臟就會(huì)快速響應(yīng)，大量合成EPO。后者通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入骨髓，促進(jìn)其中的紅系祖細(xì)胞向紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。成熟的紅細(xì)胞從骨髓中被釋放到循環(huán)系統(tǒng)，以提高機(jī)體對(duì)氧氣結(jié)合能力。腎臟感受到血液中氧氣濃度增加后會(huì)減少EPO的合成，進(jìn)而降低骨髓中的紅細(xì)胞含量。

EPO調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成示意圖

（圖片來(lái)源：修改自Simon JF and Nakhoul G.（2016）Cleve Clin J Med 83:613-624）

這就構(gòu)成了一個(gè)完美的調(diào)節(jié)閉環(huán)。而高原生活的人以及一些貧血患者常常碰到血氧含量持續(xù)低的狀況，就無(wú)法完成上述循環(huán)，刺激腎臟持續(xù)分泌EPO，使其血液中的EPO濃度高于常人。

花了近80年才揭開它的真面目

和很多重大發(fā)現(xiàn)類似，科學(xué)家對(duì)EPO的認(rèn)識(shí)不是一帆風(fēng)順的，一路伴隨著質(zhì)疑、挑戰(zhàn)。從EPO概念的提出到最終確定具體的分子花了接近80年的時(shí)間。

1906年，法國(guó)科學(xué)家Carnot 和Deflandre給正常的兔子輸注了貧血兔子的血清后，發(fā)現(xiàn)正常兔子血漿里紅細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，他們認(rèn)為血漿中某種體液因子能夠刺激調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的生成。這就是最早的EPO概念原型。遺憾的是隨后幾十年里研究者并沒(méi)有成功重復(fù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一個(gè)的主要原因是當(dāng)時(shí)對(duì)新生紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)定量并不精準(zhǔn)。

1950年Reissmann和Ruhenstroth-Bauer的異種共生實(shí)驗(yàn)給出了真正有力的證據(jù)。他們通過(guò)外科手術(shù)將兩只活體大鼠的循環(huán)系統(tǒng)連接在一起，將其中一只置于低氧環(huán)境，另一只呼吸正常的空氣，結(jié)果兩只老鼠的體內(nèi)都大量生成了紅細(xì)胞。毫無(wú)疑問(wèn)，血液循環(huán)系統(tǒng)中存在一種能夠刺激紅細(xì)胞生成的激素，促紅細(xì)胞生成素EPO由此得名。另一方面也說(shuō)明EPO對(duì)低氧非常敏感。

EPO究竟是一個(gè)什么分子？美國(guó)科學(xué)家Goldwasser用了30年的時(shí)間，最終在生物化學(xué)水平闡明了這個(gè)問(wèn)題。工欲善其事，必先利其器。EPO的功能是能刺激新生紅細(xì)胞，但后者的計(jì)數(shù)定量并不精準(zhǔn)。紅細(xì)胞里最主要的功能分子是含有血紅素的血紅蛋白，血紅素分子中心含有一個(gè)亞鐵離子，所以Goldwasser研究組用放射性的鐵同位素標(biāo)記新生的紅細(xì)胞，建立了靈敏檢測(cè)EPO活力的方法，使得從動(dòng)物體液樣本分離純化濃度極低的EPO（每毫升納克級(jí)）變得可能。但EPO的分離還是異常艱難的，他們的研究對(duì)象從腎臟換成貧血綿羊血漿、轉(zhuǎn)向因鉤蟲感染而嚴(yán)重缺鐵的病人尿液，最后在1977年從2550升日本再生障礙性貧血患者的尿液中純化得到8毫克的人EPO蛋白。

1985年，人源EPO的蛋白質(zhì)測(cè)序以及基因克隆得以完成。EPO基因編碼了一段193個(gè)氨基殘基的多肽，在分泌過(guò)程中剪切掉信號(hào)肽后成為166個(gè)氨基酸殘基組成的成熟蛋白質(zhì)，含有4個(gè)發(fā)生糖基化修飾的位點(diǎn)。1998年，EPO核磁共振溶液結(jié)構(gòu)以及EPO及其受體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)得到解析。至此，人們對(duì)EPO才有了最直觀的認(rèn)識(shí)。

EPO的三維結(jié)構(gòu)（PDB code：1BUY， PYMOL 軟件出圖），球狀標(biāo)示為糖基化位點(diǎn)

它，催生了制藥巨頭

在此之前，治療貧血一般需要通過(guò)輸血補(bǔ)充紅細(xì)胞的不足。隨著人們對(duì)EPO的認(rèn)識(shí)不斷深入，通過(guò)注射EPO刺激自身骨髓的紅細(xì)胞生成讓問(wèn)題變得更加簡(jiǎn)單。但像Goldwasser那樣直接從體液純化EPO非常困難，產(chǎn)量也很低。而EPO蛋白質(zhì)和基因序列的測(cè)定，使得大量生產(chǎn)重組人源EPO成為可能。

完成這一創(chuàng)舉的是一家叫做Applied Molecular Genetics（Amgen，安進(jìn)）的生物技術(shù)公司。Amgen成立于1980年，一開始只有7名成員，他們希望用當(dāng)時(shí)興起的分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物制藥，在他們目標(biāo)的清單上有干擾素、生長(zhǎng)激素釋放因子、乙肝疫苗、表皮生長(zhǎng)因子這些火熱的名字，然而這些嘗試無(wú)一成功。直到1985年，來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣的華人科學(xué)家林福坤克隆了人EPO的基因，進(jìn)而利用DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)了人工合成的EPO生產(chǎn)。

重組人源EPO和人體內(nèi)源的EPO蛋白質(zhì)一級(jí)序列相同，也具有類似的糖基化修飾，自然也具有內(nèi)源EPO的活力。1989年6月Amgen的第一個(gè)產(chǎn)品重組人紅細(xì)胞生成素Epogen獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)，用于治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和HIV感染治療的貧血。Epogen銷售額短短的三個(gè)月之內(nèi)就突破了1600萬(wàn)美元。隨后的20年里，Amgen在重組人源EPO市場(chǎng)里始終處于統(tǒng)治地位。僅2010年Epogen就給Amgen帶來(lái)了高達(dá)25億美元的收入。2018年，Amgen的股票市值1288億美元，位列全球制藥巨頭第八位。

值得一提的是，Amgen一開始正是同Goldwasser合作，由Goldwasser提供純化的人EPO蛋白進(jìn)行測(cè)序，但很快Goldwasser和Amgen因理念不合而分道揚(yáng)鑣。而從事基礎(chǔ)研究的Goldwasser及其所在的芝加哥大學(xué)從來(lái)都沒(méi)有想過(guò)為他發(fā)現(xiàn)的這種激素申請(qǐng)專利，所以沒(méi)有因?yàn)镋PO商業(yè)上巨大的成功獲得一分錢。

它，怎么就成了興奮劑

在我們呼吸過(guò)程中，氧氣進(jìn)入細(xì)胞的線粒體驅(qū)動(dòng)呼吸鏈，同時(shí)大量產(chǎn)生ATP，這是我們身體里能量的主要來(lái)源。貧血的人體內(nèi)缺乏足夠的健康紅細(xì)胞，最直接的影響是吸收的氧氣不足，令人覺(jué)得乏力，類似長(zhǎng)跑力竭時(shí)呼吸不暢的感覺(jué)。注射重組人源EPO后，貧血患者的機(jī)體能產(chǎn)生更多的紅細(xì)胞，運(yùn)載更多的氧氣，伴隨著更多能量分子ATP的產(chǎn)生，有效地緩解了癥狀。

然而某些體育競(jìng)技工作者也開始動(dòng)重組人源EPO的歪腦筋了，如果用EPO類型人工重組激素刺激運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)產(chǎn)生更多的紅細(xì)胞，就有可能提高運(yùn)動(dòng)員獲取氧氣和產(chǎn)生能量分子的能力，也就能夠提高運(yùn)動(dòng)員在自行車、長(zhǎng)跑、越野滑雪等耐力項(xiàng)目中的成績(jī)。1980年《應(yīng)用生理學(xué)》一篇論文表示，血液興奮劑(促紅細(xì)胞生成素、人工氧載體和血液回輸?shù)?可以使人體耐力增加34%。若運(yùn)動(dòng)員使用EPO，他們?cè)谂懿綑C(jī)上跑8公里的時(shí)間將比之前縮短44秒。事實(shí)上，自行車和馬拉松一直都是EPO類興奮劑的重災(zāi)區(qū)。1998年環(huán)法自行車賽期間，西班牙費(fèi)斯蒂納車隊(duì)的一名隊(duì)醫(yī)在法國(guó)邊境被捕，她竟然隨身攜帶了400瓶人工重組EPO藥物！結(jié)果當(dāng)然是整支車隊(duì)被踢出了環(huán)法并禁賽。

1992年巴塞羅那奧運(yùn)會(huì)上，國(guó)際奧委會(huì)就把EPO列為了違禁藥物名單，但是，重組人源EPO檢測(cè)非常困難，在2000年奧運(yùn)會(huì)之前甚至沒(méi)有方法能有效地檢測(cè)出運(yùn)動(dòng)員是否使用。原因有幾種：1）人體液中EPO含量極低，正常人每毫升血液中EPO約為130-230納克；2）人工重組EPO與人體內(nèi)源EPO蛋白質(zhì)氨基酸組成完全一樣，僅僅是糖基化形式有非常細(xì)微的不同；3）EPO在血液中的半衰期僅為5-6小時(shí)，一般在最后一次注射的4-7天后就檢測(cè)不到；4）EPO水平的個(gè)體差異性大，很難設(shè)立絕對(duì)的定量標(biāo)準(zhǔn)。

2000年開始，世界反興奮劑機(jī)把尿檢作為直接檢測(cè)重組EPO唯一科學(xué)的驗(yàn)證方法。由于人工重組EPO與人體內(nèi)源EPO糖基化形式的些微差別，兩種分子的帶電性質(zhì)有非常小的不同，能用一種名為“等電聚焦”的電泳方法區(qū)分開，這是直接法檢測(cè)人工重組EPO的主要策略。但是，某些用人來(lái)源細(xì)胞表達(dá)的重組EPO就沒(méi)有糖基化差別，所以也有專家建議用碳同位素含量的不同區(qū)分外源EPO和內(nèi)源EPO。

EPO是耐力性項(xiàng)目選手經(jīng)常使用的違禁藥物（圖片來(lái)源：http:///wp-content/uploads/2013/02/EPO.jpg）

其實(shí)，目前不同的EPO檢測(cè)方法都還存在局限，比如美國(guó)自行車傳奇人物蘭斯·阿姆斯特朗自己承認(rèn)在7次奪冠的環(huán)法自行車賽中都服用了EPO及其他興奮劑藥物，但他實(shí)際沒(méi)有在當(dāng)時(shí)任何一次興奮劑測(cè)試中被真正確認(rèn)為EPO陽(yáng)性。到底是“道高一尺”還是“魔高一丈”，我們還要拭目以待。

它，如何成就諾獎(jiǎng)

最后聊兩句EPO和2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)間的聯(lián)系。

EPO是人體感受并響應(yīng)低氧最典型的案例，所以Semenza和Ratcliffe這兩位諾獎(jiǎng)得主不約而同選擇以EPO入手研究細(xì)胞對(duì)低氧感知與適應(yīng)機(jī)制，第一步就是尋找EPO基因能夠響應(yīng)氧氣變化的元件。Semenza在編碼EPO蛋白的基因序列下游3’端找到一段256個(gè)堿基關(guān)鍵的非編碼序列，命名為低氧應(yīng)答元件（hypoxia response element）。如果突變或刪除這段元件序列，EPO蛋白就對(duì)低氧的響應(yīng)能力大大下降。如果把這段元件序列融合到其他與其他與低氧無(wú)關(guān)的基因下游3’端，這些改造后的基因在低氧條件下也出現(xiàn)了類似EPO的激活。

隨后Ratcliffe課題組發(fā)現(xiàn)，這一低氧應(yīng)答元件并不只存在于負(fù)責(zé)生成EPO的腎臟或者肝臟細(xì)胞中，在其他更多的細(xì)胞類型中，都能在低氧條件下發(fā)揮作用。換句話說(shuō)，這種對(duì)低氧的響應(yīng)可能并不是EPO所專有的，而是細(xì)胞中更廣泛存在的一種現(xiàn)象。這些不負(fù)責(zé)生成EPO的其他細(xì)胞中必定含有某些分子（比如負(fù)責(zé)開啟基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子）能夠感受到氧氣濃度的變化，結(jié)合到低氧應(yīng)答元件上開啟EPO等基因的表達(dá)。

細(xì)胞響應(yīng)低氧的分子機(jī)制。正常氧氣條件下，低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α被修飾反應(yīng)添上了兩個(gè)羥基（-OH），就能夠被VHL識(shí)別并打上了“待分解”標(biāo)簽，從而被蛋白酶體分解。低氧情況下HIF-1α的羥基化反應(yīng)無(wú)法發(fā)生不會(huì)被降解能在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，和ARNT組合成缺氧誘導(dǎo)因子HIF，能結(jié)合到特定的低氧應(yīng)答元件（HRE），開啟EPO類似基因的表達(dá)。（圖片來(lái)源：https://www./）

而低氧應(yīng)答元件的發(fā)現(xiàn)，也為找到這類轉(zhuǎn)錄因子提供了工具。Semenz課題組的王廣良博士用EPO基因的低氧應(yīng)答元件作鉺，在幾百升細(xì)胞裂解液中釣到了一個(gè)叫低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1, HIF-1）。最終HIF-1被證實(shí)正是響應(yīng)低氧上調(diào)EPO基因的轉(zhuǎn)錄因子，但它并不僅僅只負(fù)責(zé)調(diào)控EPO基基因的表達(dá)，它的下游至少有幾百個(gè)基因，廣泛地參與包括腫瘤生成在內(nèi)的生物學(xué)進(jìn)程。在近期的諾獎(jiǎng)解讀文章中已有很多的介紹，這里就不贅述了。

EPO是天使還是惡魔，我沒(méi)有答案，但毫無(wú)疑問(wèn)它就是一個(gè)神奇的分子。