劉必成 教授

東南大學附屬中大醫(yī)院

EPO是腎臟分泌的一種糖蛋白類激素，能與紅細胞表面的EPO受體結(jié)合，刺激紅細胞增生、分化和成熟[1]。紅細胞生成刺激劑（erythropoiesis-stimulating agents, ESAs）的臨床應用是腎性貧血治療的一個里程碑，極大減輕了慢性腎衰竭患者對輸血的依賴和輸血帶來的風險，改善了CKD患者的預后。第1代ESAs是重組人促紅細胞生成素，是一種免疫學及生物學特性均與人EPO極其相似的唾液酸蛋白激素，由于其半衰期短，每周需給藥1-3次[2]。隨后半衰期較長的第2代ESAs達依泊汀α，第3代ESAs甲氧基-聚乙二醇EPOβ應運而生[3,4]。生物仿制EPO以及EPOθ也在許多國家授權使用[5]。

隨著ESAs在臨床的廣泛應用，盡管越來越多的貧血患者得到治療，然而，目前使用的ESAs也有諸多不足，比如需要冷藏保存、反復靜脈或皮下給藥等，給許多CKD非透析患者帶來不便，而對血液透析患者，靜脈給藥增加了護士的工作量。此外，許多臨床研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)ESAs的使用，還有引起血壓升高、血栓形成、增加心血管事件發(fā)生以及產(chǎn)生抗體導致純紅細胞再障等副作用，使其臨床應用受到了一定的限制[6]。

此外，經(jīng)驗性應用ESAs治療的過程中人們還發(fā)現(xiàn)，在糾正貧血的過程中鐵劑的消耗增加，導致功能性的鐵缺乏，從某種程度上增加了鐵調(diào)素的水平[7]。而給予靜脈鐵劑，盡管可能會減少ESAs的使用劑量，改善貧血，但是沒有改善鐵調(diào)素上調(diào)導致的鐵利用障礙。因此，尋找新型腎性貧血治療藥物具有十分重要的臨床意義。

低氧是刺激紅細胞生成的經(jīng)典途徑，在闡明這個應答機制的過程中，人們發(fā)現(xiàn)了EPO和HIF轉(zhuǎn)錄因子。HIFs是參與細胞低氧應答的主要介質(zhì)，早在1992年，Semenza和Wang在低氧的肝癌細胞株Hep3B的細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)，HIFs可以與EPO基因增強子的寡核苷酸序列特異性的結(jié)合，促進EPO基因轉(zhuǎn)錄[8]。無論是在低氧應激或者正常情況下，HIFs都是紅細胞生成所必須的。在轉(zhuǎn)基因動物模型中，HIFs表達缺失可導致貧血的發(fā)生。與此同時，HIFs過表達可導致紅細胞生成增多[9,10]。

EPO是由HIFs調(diào)節(jié)的廣泛分布的低氧誘導基因表達的一部分。HIFs以異二聚體形式存在，包含一種氧敏感α亞基和一種組成性表達β亞基[11]。目前已證實哺乳動物中有3種α亞基：HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α，目前研究主要集中在HIF-1α和HIF-2α，它們在調(diào)節(jié)細胞低氧應答中發(fā)揮了至關重要的作用。HIF-1α普遍存在，它與HIF-2α協(xié)同，可以促進氧的轉(zhuǎn)運以及細胞對低氧的應答，改變特定細胞的基因表達，從而提高腎臟和肝臟的EPO表達，增加鐵的利用，改變骨髓微環(huán)境，促進紅系祖細胞成熟和增殖[12]。雖然HIF-1α和HIF-2α共同調(diào)節(jié)了許多基因表達，但在成人，EPO合成以及鐵代謝主要由HIF-2α調(diào)控[13]。

HIF-α亞基持續(xù)不斷生成的同時，也在不斷的降解。因此，控制HIF-α的降解速度是調(diào)控HIFs活性和紅細胞生成的關鍵因素。HIF-1α和HIF-2α各包含兩個脯氨酸殘基，在正常情況下，氧依賴性HIFs的降解始于脯氨酰-4-羥化酶結(jié)構(gòu)域（prolyl-4-hydroxylase domain, PHD）介導的HIF-α亞基的脯氨酸羥化[13]。PHD包括PHD1，PHD2和PHD3三種酶或者跨膜PHD蛋白，屬于2-氧化戊二酸（2-OG）依賴的加雙氧酶，以氧為基質(zhì)，羥化HIF-α特異性的脯氨酸殘基，羥化的HIF-α隨即被VHL泛素連接酶復合物識別降解[14]。

PHD2是調(diào)節(jié)HIFs活性的主要羥化酶，研究表明，PHD2基因突變導致其催化活性受到抑制，會引起紅細胞生成增多[15]。在低氧情況下，PHD羥化受到抑制，HIFs信號通路激活。腎臟是合成EPO最主要的場所，同時也在不同的細胞中表達PHD1、PHD2和PHD3，然而研究發(fā)現(xiàn)，在EPO合成細胞中可以觀察到所有PHDs的基因轉(zhuǎn)錄[16]。此外，在HIF-α羧基端反式激活結(jié)構(gòu)域，HIF抑制因子可以通過催化天冬酰胺殘基羥基化，調(diào)節(jié)共激活因子活化，轉(zhuǎn)錄激活HIF二聚體[15]。（HIFs降解以及低氧誘導紅細胞生成示意圖，見圖1）

低氧情況下，HIF-2α通過HIF-PHD氧敏感信號通路使EPO生成增加，進而引起紅細胞生成增多。與此同時，該信號通路也可通過增加鐵攝入以及鐵的利用率，滿足骨髓造血的需求。HIF-2α在鐵的攝入中發(fā)揮重要作用，在鐵缺乏動物模型中，它可以增加二價金屬轉(zhuǎn)運體1（divalent metal transporter 1, DMT1）和十二指腸細胞色素b還原酶（DCYTB）1基因轉(zhuǎn)錄[14]。DMT1主要負責將鐵轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，DCYTB可以減少在鐵劑被腸道攝取之前的三價鐵（Fe3+）向二價鐵（Fe2+）轉(zhuǎn)化。其他HIFs調(diào)節(jié)的參與鐵代謝的因子包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、血漿銅藍蛋白、血紅素加氧酶-1、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ferroportin, FPN）等，其中FPN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的細胞鐵輸出蛋白，參與細胞內(nèi)鐵向血漿轉(zhuǎn)運，并且可以被鐵調(diào)素降解[17，18]。

鐵調(diào)素是由25個氨基酸組成的小分子活性肽，主要由肝細胞產(chǎn)生，可以抑制腸道鐵的吸收以及機體貯備鐵的釋放。炎癥可促進鐵調(diào)素表達增加，從而引起腸道鐵吸收減少和巨噬細胞鐵潴留。CKD患者由于炎癥刺激以及腎臟對鐵調(diào)素排泄減少，導致鐵調(diào)素表達增加，最終導致鐵利用障礙性貧血的發(fā)生，這可能也是腎性貧血的機制之一[19]。研究表明，低氧誘導HIFs信號通路的激活，抑制肝臟鐵調(diào)素合成，可以增加鐵的攝取和利用。早期的研究表明， HIF-1α可以和鐵調(diào)素mRNA啟動子結(jié)合，影響其轉(zhuǎn)錄[20]。

然而隨后的動物實驗模型證明，HIFs誘導的鐵調(diào)素表達抑制主要依賴于EPO介導的紅細胞生成增多，提示HIF-2α介導的EPO表達增加是HIF抑制鐵調(diào)素表達的主要機制，而不是HIF-1α對鐵調(diào)素基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，這一假設在隨后的研究中已被證實[21]。（HIFs對鐵代謝的影響，見圖2）

如上所述，藥理學激活HIFs有可能為治療腎性貧血提供新的治療策略。HIFs穩(wěn)定劑主要是指PHD抑制劑，通過與包含二價鐵的激活位點結(jié)合，抑制2-OG共底物，進而抑制PHD催化活性。HIFs穩(wěn)定劑可維持血漿EPO濃度在一個相對生理學范疇，這就避免了大劑量靜脈給藥造成EPO過量，減少心血管事件的發(fā)生，同時可以增加鐵的吸收和利用，減少靜脈鐵劑的使用。

然而PHDs屬于2-OG依賴加氧酶超家族，因此，理論上講PHD抑制劑可以影響其他非HIFs作用靶點的2-OG依賴加氧酶，這種潛在的脫靶效應需要在進行臨床實驗前謹慎評估[22]。HIFs增多本身也存在一定風險，研究證明，HIFs參與血管緊張性以及血壓的調(diào)節(jié)，可以導致肺動脈高壓的發(fā)生[11]。此外，激活HIFs信號可以引起許多惡性腫瘤的發(fā)生，參與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的調(diào)控，對血管再生也有一定作用[11,23]。與到目前為止，有6種以促進EPO合成以及激活HIFs為目的的PHD抑制劑在臨床試驗中注冊。

FG-2216在原理循證研究中，PHD抑制劑FG-2216可以顯著提高血液透析患者的血漿EPO濃度，令人驚訝的是， FG-2216對無腎患者也有一定的功效[24]。然而該實驗也存在嚴重的不良事件，由于一例致死性肝壞死的發(fā)生，導致該藥物的II期臨床實驗被FDA臨時叫停。

FG-4592可以同時抑制三種HIF-PHD，半衰期約12小時，并且可以每二周或者每三周一次口服給藥，劑量從1mg/kg到2mg/kg不等。目前，研究已證實，在血液透析、腹膜透析以及非透析CKD患者中，F(xiàn)G-4592都有良好的耐受性，可以維持Hb濃度在靶目標范圍內(nèi)，對鐵代謝也有一定的作用[25]。FG-4592可以增加總鐵結(jié)合力，降低血清鐵蛋白水平，并且可以降低鐵調(diào)素的濃度。此外，F(xiàn)G-4592對紅細胞生成的作用不受炎癥因素的影響[25]。目前FG-4592已進入III期臨床研究。

GSK1278863由葛蘭素史克公司研發(fā)，已進入II期臨床試驗，可以抑制PHD2和PHD3的活性，同時增加HIF-1α和HIF-2α的穩(wěn)定性。在小鼠模型中，GSK1278863 60mg/kg口服給藥，可以迅速提高肝臟EPO mRNA的表達，以及6小時后可觀察到腎臟EPO mRNA表達增加，與基線水平相比，在給藥6-8小時后可以觀察到血漿EPO濃度升高8倍以上[14]。近期的一項多中心隨機單盲安慰劑對照平行研究表明，與安慰劑組相比，無論在CKD3-5期非透析患者還是CKD5期血液透析患者中，GSK1278863均可導致劑量依賴性血漿EPO濃度升高，從而使Hb達到靶目標值，此外，在所有給藥組中還可觀察到劑量依賴性的鐵調(diào)素水平下降以及總鐵結(jié)合力和不飽和鐵結(jié)合力的提高[26]。

AKB-6548穩(wěn)定HIF-2α的能力較HIF-1α更為明顯，并且對提升血漿EPO濃度也存在劑量依賴性，已完成IIb期臨床實驗。2016年完成的為期20周的隨機雙盲安慰劑對照研究發(fā)現(xiàn)，在CKD患者中可以觀察到AKB-6548具有較好的耐受性，并且可以維持Hb濃度在靶目標范圍內(nèi)，與目前臨床常用的ESAs相比，其優(yōu)勢在于提升血漿EPO更符合生理要求范疇，Hb波動范圍相對較小，Hb濃度超過130g/L的比例相對較小。跟其他HIFs穩(wěn)定劑類似， AKB-6548可以提高血清總鐵結(jié)合力，降低血清鐵蛋白和鐵調(diào)素水平[27]。與既往的研究不同，還研究發(fā)現(xiàn)，AKB-6548治療組的VEGF并沒有明顯的升高，在后續(xù)的研究中，仍需進一步確認。

BAY85-3934 拜耳公司研發(fā)，結(jié)構(gòu)上與之前提到的HIF穩(wěn)定劑有所不同，它可以同時抑制3種HIF-PHD，尤其是對PHD2的抑制更加明顯，目前已進入II期臨床實驗[28]。在腎衰以及炎癥性貧血動物模型中，BAY85-3934可以有效的提高EPO的濃度，此外，在腎切除大鼠中還觀察到該藥物具有抗高血壓以及心臟保護作用[28]。

其它HIFs穩(wěn)定劑：目前注冊的HIFs穩(wěn)定劑，如JTZ-951和DS-1093正處于動物實驗階段，臨床前研究資料尚未發(fā)表[14]。