多數(shù)癌癥可被免疫系統(tǒng)識(shí)別并攻擊，但是因?yàn)槟[瘤介導(dǎo)的免疫抑制和免疫逃逸機(jī)制而進(jìn)展不一。輸注體外工程化T細(xì)胞，即T細(xì)胞過(guò)繼療法(adoptedT cell therapy)，能增加患者的天然抗腫瘤免疫反應(yīng)?；虔煼ㄖ囟ㄏ蛎庖咛禺愋耘c基因編輯相結(jié)合具有改善療效并增加工程化T細(xì)胞安全性的潛力。CRISPR與Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)偶聯(lián)核酸內(nèi)切酶是一項(xiàng)強(qiáng)有力的基因編輯技術(shù)，具有靶向T細(xì)胞中多個(gè)基因來(lái)改善腫瘤免疫療法的能力。工程化T細(xì)胞療法給癌癥治療帶來(lái)了革命性的變化，在血液相關(guān)癌癥，如白血病和淋巴瘤的治療過(guò)程中獲得了長(zhǎng)期持續(xù)的緩解。該療法涉及取出患者T細(xì)胞，“重新編輯”使其攻擊癌細(xì)胞，然后再將它們轉(zhuǎn)移回患者。使用CRISPR-Cas9的靶基因滅活(敲除)能增強(qiáng)T細(xì)胞活性，并且有擴(kuò)增細(xì)胞療法應(yīng)用的潛力。然而直到現(xiàn)在，仍然不知CRISPR-Cas9編輯T細(xì)胞在回輸人體后能否耐受并增殖。Stadtmauer等人發(fā)表了I期臨床試驗(yàn)(NCT03399448)晚期難治性癌癥患者接受CRISPR-Cas9修飾T細(xì)胞治療的數(shù)據(jù)，他們將這種細(xì)胞稱(chēng)為CRISPR-Cas9 NYCE T細(xì)胞。結(jié)果顯示了基因編輯的治療性應(yīng)用的一項(xiàng)重要進(jìn)展，并突出了加速開(kāi)發(fā)細(xì)胞療法的潛力。圖表1. CRISPR-Cas9 NYCE T 細(xì)胞示意來(lái)源：《Science》，中康產(chǎn)業(yè)投資研究中心
工程化細(xì)胞療法的生產(chǎn)涉及用脫毒病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)分離出的患者T細(xì)胞，使其通過(guò)表達(dá)嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors,CARs)識(shí)別呈現(xiàn)在癌細(xì)胞表面的抗原，或者通過(guò)表達(dá)T細(xì)胞受體(Tcell receptors, TCRs)識(shí)別癌細(xì)胞內(nèi)的癌癥相關(guān)多肽抗原。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，工程化T細(xì)胞數(shù)量被擴(kuò)增，然后回輸病人體內(nèi)。雖然對(duì)治療一些類(lèi)型的癌癥高度有效，工程化T細(xì)胞活性的特異性和壽命可被改善。例如，T細(xì)胞活性通過(guò)PD-1(程序性細(xì)胞死亡蛋白1)受體被天然下調(diào)。系統(tǒng)性抑制患者的PD-1能增強(qiáng)T細(xì)胞活性，但經(jīng)常誘發(fā)不良自體免疫反應(yīng)。此外，內(nèi)源性的TCR表達(dá)與工程化T細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因受體競(jìng)爭(zhēng)，干擾信號(hào)傳遞或細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。敲除TCR基因和編碼PD-1的PDCD1基因在臨床前人腫瘤異種移植小鼠模型中能增強(qiáng)工程化人體T細(xì)胞活性。上文提到，Stadtmauer等測(cè)試了CRISPR-Cas9敲除這些基因的患者衍生T細(xì)胞在回輸人體后是否安全和持久。圖表2. CRISPR-Cas9基因編輯修飾的工程化T細(xì)胞治療流程來(lái)源：《Science》，中康產(chǎn)業(yè)投資研究中心
一項(xiàng)試驗(yàn)入組了六名骨髓瘤或肉瘤患者，其中三名滿(mǎn)足T細(xì)胞回輸?shù)难芯繕?biāo)準(zhǔn)。通過(guò)兩步處理來(lái)獲得原生TCR和PDCD1基因敲除，以及在工程化細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因TCR的表達(dá)。在第一步，分離出的患者T細(xì)胞用預(yù)成型的Cas9蛋白的核糖核蛋白(RNP)電穿孔，并引導(dǎo)RNA靶向內(nèi)源性TCR-TCRα(TRAC)、TCRβ(TRBC)及PDCD1，進(jìn)行基因中斷。在第二步，細(xì)胞用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)轉(zhuǎn)基因TCR，其能識(shí)別癌癥-睪丸抗原(NY-ESO-1)，并且在培養(yǎng)基中擴(kuò)增以產(chǎn)生NY-ESO-1轉(zhuǎn)導(dǎo)CRISPR 3X編輯細(xì)胞(NYCE)細(xì)胞。值得一提的是，NYCE細(xì)胞消除了表達(dá)NY-ESO-1的細(xì)胞，比單獨(dú)表達(dá)NY-ESO-1 TCR的T細(xì)胞更加有效，符合成功敲除內(nèi)源性TCR的預(yù)期結(jié)果。圖表3. 患者統(tǒng)計(jì)資料 來(lái)源：《Science》,中康產(chǎn)業(yè)投資研究中心(*定量聚合鏈反應(yīng)(qPCR)，**免疫組織化學(xué)) NYCE細(xì)胞成功植入全部患者，并且在回輸9個(gè)月之后仍可被檢測(cè)到。未經(jīng)CRISPR基因編輯的、表達(dá)NY-ESO-1 TCR的T細(xì)胞在此前的臨床試驗(yàn)中輸注后的半衰期約為1周。從一名研究參加者重新分離出的NYCE細(xì)胞的基因表達(dá)特征與中央記憶細(xì)胞一致，標(biāo)志著穩(wěn)定的移植。此結(jié)果與之前的研究形成鮮明對(duì)比，表達(dá)NY-ESO-1 TCRs的未編輯細(xì)胞展示出T細(xì)胞耗竭的標(biāo)記物。CRISPR-Cas9對(duì)內(nèi)源性TCR和PD-1的中斷改善了工程化T細(xì)胞的細(xì)胞殺傷能力并且促進(jìn)了長(zhǎng)期的持續(xù)性。CRISPR-Cas9編輯細(xì)胞的人體安全性是必須考慮的重要問(wèn)題。目前不清楚Cas9編輯的細(xì)胞是否將有免疫原性，也不清楚殘留的細(xì)菌蛋白Cas9是否將會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)。Stadtmauer等報(bào)道在三名患者中未觀察到NYCE細(xì)胞的編輯相關(guān)毒性。此外，雖然研究參與者有預(yù)先存在的T細(xì)胞和Cas9蛋白的特異性抗體，抗體滴定在整個(gè)研究過(guò)程中未從基線增加。Cas9免疫反應(yīng)缺失可能歸因于接受NYCE細(xì)胞患者的免疫抑制，或者是因?yàn)镃as9作為一個(gè)非病毒、預(yù)先形成的RNP遞送。與病毒遞送導(dǎo)致被治療細(xì)胞持續(xù)表達(dá)Cas9相比，RNP在細(xì)胞中的半衰期有限。Stadtmauer等也報(bào)道了CRISPR-Cas9的最小脫靶編輯，不超過(guò)1%的NYCE細(xì)胞在回輸后含有染色體易位減少。這些發(fā)現(xiàn)為安全生產(chǎn)和無(wú)免疫性給予基因編輯體細(xì)胞提供了指南。現(xiàn)存尚未解答的最大問(wèn)題是CRISPR編輯的工程化T細(xì)胞對(duì)于晚期癌癥是否有效。關(guān)于NYCE細(xì)胞的I期試驗(yàn)評(píng)估了安全性，但治療患者的療效并未評(píng)估。在研究末期，一名參與者因癌癥進(jìn)展死亡，另外兩名患者接受了其他療法。雖然Cas9工程化細(xì)胞的療效因此而模糊，此研究受到2016年出臺(tái)的編輯方案限制。此研究的基因中斷效率一般(15到45%)，然而現(xiàn)存的方案使用Cas9RNPs在人T細(xì)胞中獲得超過(guò)90%的基因中斷。此外，近期工作已證實(shí)CAR轉(zhuǎn)基因插入人T細(xì)胞TRAC基因，同時(shí)導(dǎo)致內(nèi)源性TCR的敲除，同時(shí)通過(guò)原生啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CAR的表達(dá)。在產(chǎn)生精準(zhǔn)基因修飾及其他癌癥相關(guān)靶點(diǎn)選擇方面的進(jìn)步，可增強(qiáng)工程化T細(xì)胞治療其他癌癥的療效，包括實(shí)體瘤，大部分對(duì)工程化細(xì)胞療法的活性具有抗性。臨床證實(shí)的CRISPR基因編輯細(xì)胞的長(zhǎng)期安全性為下一代基于細(xì)胞的療法鋪平了道路。雖然其他類(lèi)型基因編輯體細(xì)胞(如干細(xì)胞)的安全性仍然待定，但是振奮人心的消息是首批輸注CRISPR-Cas9修飾細(xì)胞的β地中海貧血和鐮狀細(xì)胞貧血患者顯示出健康的血液產(chǎn)生。隨著更多的基因標(biāo)記療法被證明安全且有效，臨床轉(zhuǎn)化的障礙將成為細(xì)胞制造和給藥。工程化細(xì)胞的生產(chǎn)工藝和修飾體內(nèi)靶細(xì)胞的CRISPR-Cas9遞送策略亟待重構(gòu)以減少成本，使這些革命性的療法惠及能夠獲益的患者。
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