目前，CRISPR/Cas9技術一方面被廣泛的用于通用型CAR-T細胞的開發(fā)，擴展CAR-T細胞的應用范圍；另一方面也被廣泛的用于包含T細胞在內的免疫細胞的修飾，以增強其抗腫瘤效果。雖然，CRISPR/Cas9技術的應用仍然面臨著許多安全性、有效性等問題，但毫無疑問該技術將在下一代新型的CAR-T技術開發(fā)中具有重要的作用。

1、使用CRISPR/Cas9技術

破壞影響T細胞功能的抑制性分子

腫瘤細胞可以通過表達負性信號通路調節(jié)分子來抑制免疫反應或者逃脫免疫細胞的殺傷，這些負性信號通路分子被稱作免疫檢查點。PD1是一個重要的免疫檢查點分子，其信號通路的活化可以顯著抑制T細胞的增殖和免疫反應。

目前CRISPR/Cas9編輯的TCRα基因和PD-1基因敲除CAR-T細胞臨床應用的安全性及其治療的可行性已經在一項研究中得到了驗證。在一項研究中，研究者發(fā)現(xiàn)：CRSISPR/Cas9對內源性的TCRα和PD-1基因有著較高的編輯效率，但對TCRβ基因的編輯效率較低。同時，該項研究結果顯示CRISPR/Cas9編輯的T細胞在體內能夠存活近9個月，而且僅有低水平的臨床毒副作用[4]。

在另外一項研究中，Rupp等人通過電轉的方式將Cas9和靶向PD-1基因1號外顯子的sgRNA轉入T細胞中，隨后用含有CD19 CAR基因的慢病毒轉染該細胞。結果顯示：在PDL1＋CD19＋腫瘤細胞構建的小鼠模型中，PD-1基因敲除的CD19 CAR-T細胞能夠有效的清除腫瘤細胞。這一結果表明PD-1/PDL1信號通路在調節(jié)T細胞功能方面具有重要的作用[5]。

2、抗自殺型CAR-T細胞的構建

最近有一種新型的靶向CD7的抗自殺的CAR T細胞的研究報道，在該項研究中，研究人員使用CRISPR/Cas9技術對T細胞的TCR和CD7分子進行了敲除，TCR的敲除能夠避免CAR-T用于異體治療時引起的GVHD風險，CD7的敲除使CAR-T細胞能夠避免相互自殺。

在該項研究中，CD7 CAR-T細胞在體內外多種CD7+白血病細胞系和腫瘤動物模型中均展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，同時并未引起GVHD反應。因此，該項CD7 CAR-T技術的開發(fā)對復發(fā)難治性的急性T淋巴細胞白血病以及非霍奇金T細胞淋巴瘤的治療將具有極其重要的意義[6]。

3、降低CAR-T細胞臨床應用中的細胞因子風暴

考慮到粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）在誘發(fā)細胞因子風暴（中的重要作用，一些研究者聚焦于如何減弱GM-CSF對細胞因子風暴的誘發(fā)。GM-CSF在造血干細胞分化以及增殖方面具有重要作用。

2019年，Sterner等人使用CRISPR/Cas9對CD19 CAR-T細胞的GM-CSF基因進行敲除。該項研究結果表明，GM-CSF基因敲除的CAR-T細胞的GM-CSF的分泌的確明顯減弱，但是對CAR-T細胞的重要功能并未造成影響，更重要的是GM-CSF缺陷的CD19 CAR-T細胞比野生型的CD19 CAR-T細胞在體內具有明顯的抗腫瘤效果[7]。

4、通用型CAR-T細胞的制備

通用型CAR-T（UCAR-T）細胞可以使用健康供者的T細胞來制備，同時還可以實現(xiàn)批量生產，產品均一性更好，可以大大拓寬CAR-T細胞免疫療法的應用范圍。因此，通用型CAR-T細胞治療產品是下一代CAR-T細胞開發(fā)的重要方向。

目前通用型CAR-T細胞的開發(fā)主要是通過對T細胞TCR基因和β2M基因的敲除或者沉默來實現(xiàn)的，而CRISPR/Cas9基因敲除技術是通用CAR-T開發(fā)應用的主流技術。Eyquem等人使用CRISPR-Cas9技術對TCRα恒定區(qū)進行敲除，其sgRNA靶向位置為TCRα第一個外顯子的5'端，隨后使用AAV將被同源臂包圍的CD19 CAR基因序列遞送到該細胞中，通過同源重組的方式將CD19 CAR基因插入TCR位點，結果顯示接近95%的T細胞的TCR被敲除。進一步的NALM6小鼠體內腫瘤模型實驗結果顯示：僅僅回輸1×105個CAR-T細胞便能夠有效的控制腫瘤細胞的生長，同時僅有2%的T細胞表達PD1、LAG3和TIM3等抑制性受體[8]。這些抑制性受體的低表達可能是取得良好的抗腫瘤效果的主要原因。這一研究結果為我們描繪了如何通過基因編輯技術來增強CAR-T細胞抗腫瘤效果的美好圖景。