作者 l At.Zhou

編輯 l 小卒子

在今年2月23號(hào)，Gilead旗下公司Kite與Sangamo Therapeutics達(dá)成全球合作，使用Sangamo的鋅指核酸酶ZNFs技術(shù)平臺(tái)開(kāi)發(fā)下一代腫瘤學(xué)離體細(xì)胞治療。根據(jù)協(xié)議的條款，Sangamo將獲得1.5億美元的預(yù)付款，并有資格獲得高達(dá)30.1億美元的潛在付款。這并不是CAR-T與基因編輯的第一次合作，早在2015年1月，Novartis宣布與Intellia Therapeutics展開(kāi)一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)5年的研發(fā)合作計(jì)劃，主要致力于加速發(fā)展CRISPR/Cas9技術(shù)在CAR-T細(xì)胞治療的應(yīng)用；同年5月，Juno與Editas簽訂了一項(xiàng)為期三年的合作協(xié)議，將借助Editas公司開(kāi)發(fā)的CRISPR/Cas9技術(shù)輔助公司現(xiàn)在開(kāi)發(fā)的CAR-T療法和TCR療法治療更多類型的腫瘤類型，這項(xiàng)協(xié)議包括了4700萬(wàn)美元預(yù)付款和6億9千萬(wàn)美元的里程碑獎(jiǎng)金。

2017年可以被稱為細(xì)胞免疫治療元年，Novartis的CAR-T產(chǎn)品Kymriah和Kite的產(chǎn)品Yescarta的獲批上市，極大地推動(dòng)了細(xì)胞免疫治療研發(fā)的熱情，而CAR-T與基因編輯合作，其碰撞的火花將會(huì)促進(jìn)新一代細(xì)胞免疫治療的發(fā)展。

現(xiàn)在絕大多數(shù)的CAR-T臨床實(shí)驗(yàn)都是使用的自體型CAR-T，但是病人自身的T細(xì)胞通常都存在質(zhì)量與數(shù)量的缺陷；且自體型CAR-T的生產(chǎn)成本更加昂貴，大約為通用型CAR-T的五倍；自體型CAR-T需要私人定制，而通用型CAR-T能夠做到現(xiàn)貨供應(yīng)（off-the-sheff），節(jié)約時(shí)間。然而異體型T細(xì)胞上的抗原受體TCR可能會(huì)識(shí)別接受者體內(nèi)的異體抗原，從而引發(fā)移植物抗宿主病（GVHD）；此外，異體T細(xì)胞上的HLA表達(dá)也會(huì)迅速地引起宿主免疫細(xì)胞排斥反應(yīng)。因此使用ZFNs，TALENs以及CRISPR/Cas9等基因編輯工具，敲除異體T細(xì)胞上的TCR，MHC以及相關(guān)信號(hào)通路基因，從而防止異體型CAR-T的宿主排斥反應(yīng)，是實(shí)現(xiàn)通用型CAR-T的關(guān)鍵一步。此外敲除PD1與CTLA4等T細(xì)胞抑制信號(hào)分子，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的功能。

此次與Kite達(dá)成合作的Sangamo是ZFNs技術(shù)的專利擁有者，Sangamo目前有多項(xiàng)使用ZFNs基因編輯治療罕見(jiàn)病臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。Editas Therapeutics與Intellia Therapeutics則是基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9的領(lǐng)跑者，其創(chuàng)始人分別為學(xué)術(shù)大牛張峰和Jennifer Doudna。而走在通用型CAR-T研發(fā)最前沿的是法國(guó)公司Cellectis，其利用自身Talens技術(shù)平臺(tái)研發(fā)的UCART已處于臨床階段。本文將主要介紹UCART的產(chǎn)品和生產(chǎn)過(guò)程，以及CRISPR/Cas9技術(shù)用于編輯CART細(xì)胞的最新進(jìn)展。

UCART產(chǎn)品介紹
UCART與自體型CAR-T有一些共同特征：它們都由慢病毒轉(zhuǎn)染從而攜帶識(shí)別腫瘤上特定抗原的嵌合抗原受體CAR；它們通過(guò)CAR識(shí)別腫瘤細(xì)胞從而發(fā)揮殺傷作用。UCART的獨(dú)特點(diǎn)在于原材料是健康捐獻(xiàn)者的血液，并不依賴于病人的淋巴細(xì)胞；并非定制的細(xì)胞療法，而是能夠現(xiàn)貨供應(yīng)，為更多的病人提供治療；UCART通過(guò)TALEN基因編輯技術(shù)，敲除TCR等相關(guān)基因，避免移植物抗宿主病，敲除PD1等免疫檢查點(diǎn)，進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的功能。

▲ Cellectis公司UCART簡(jiǎn)介

目前Cellectis公司有兩款UCART產(chǎn)品正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，UCART19和UCART123。其中UCART19攜帶靶向CD19的CAR，主要用于治療急性淋巴白血?。ˋLL）；UCART123攜帶靶向CD123的CAR，CD123主要在急性髓細(xì)胞性白血病（AML）以及BPDCN的白血病細(xì)胞上表達(dá)。

▲ UCART19和UCART123

UCART19和UCART123都采用的是第二代CARs，使用了鼠源的scFV，含有41BB和CD3ζ兩個(gè)共激活結(jié)構(gòu)域；此外在CAR上還添加了一個(gè)RQR8基因，RQR8是一個(gè)136aa的蛋白，它能夠被CD34的抗體QBEnd10識(shí)別，因此能夠通過(guò)Miltenyi CliniMACS的CD34篩選系統(tǒng)進(jìn)行臨床級(jí)別的分選；此外RQR8還含有兩個(gè)利妥昔單抗的模擬表位，能夠在發(fā)生安全問(wèn)題時(shí)，通過(guò)利妥昔單抗迅速清除CAR-T細(xì)胞。

▲ UCART的CAR構(gòu)建設(shè)計(jì)

此外，對(duì)于UCART19和UCART123，它們都是用了TALEN技術(shù)敲除了TRAC基因，從而降低了移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)。在UCART19中還額外敲除了CD52基因，由于在注射UCART19細(xì)胞前，急性淋巴細(xì)胞白血病ALL患者通常需要接受淋巴細(xì)胞耗竭的化療與anti-CD52（alemtuzumab）血清療法，因此UCART中敲除CD52基因能夠避免UCART產(chǎn)品受到alemtuzumab的影響。

▲ UCART19 TALEN設(shè)計(jì)與TALEN轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)水平

UCART GMP 生產(chǎn)過(guò)程
UCART的生產(chǎn)過(guò)程與自體CART大體上類似，不同點(diǎn)在于UCART的原材料是健康捐獻(xiàn)者的血液而非病人自身的血液，其次UCART生產(chǎn)過(guò)程中多了一步，引入基因編輯工具敲除某些特定基因。在目前的自體型CART生產(chǎn)工藝中，Kite的工藝最為簡(jiǎn)便，周期也最短，為10天左右；Novartis的生產(chǎn)工藝最為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)后期優(yōu)化后周期仍有22天；Juno的生產(chǎn)周期在14-18天左右。目前UCART的GMP生產(chǎn)周期大約為19天，其具體過(guò)程如下。

▲ UCART GMP生產(chǎn)過(guò)程

UCART初始材料：健康捐贈(zèng)者細(xì)胞
首先從健康的美國(guó)捐獻(xiàn)者血液中分離單核細(xì)胞（MNCs），這些捐獻(xiàn)者血液來(lái)自FDA批準(zhǔn)的，加利福尼亞州批準(zhǔn)的，美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)（AABB）認(rèn)可的，臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（CLIA）認(rèn)證的血庫(kù)。

所有的捐獻(xiàn)者都需要經(jīng)過(guò)挑選，篩選（采集前的14天內(nèi)）和檢測(cè)（采集的當(dāng)天）。
所有的人類細(xì)胞的捐獻(xiàn)，獲得，檢測(cè)，加工和存儲(chǔ)都遵循歐盟和美國(guó)的相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)意見(jiàn)。

從MNCs中分離淋巴細(xì)胞（一般的產(chǎn)量大于4x10⁹ cells），一次UCART生產(chǎn)的初始細(xì)胞數(shù)目通常為收集到細(xì)胞的1/5-1/3（10⁹ cells左右）。

Day1到Day4：第一次T細(xì)胞改造（慢病毒感染）
使用識(shí)別CD3/CD28的抗體偶聯(lián)beads激活T細(xì)胞。
使用GMP級(jí)別的，由第三代慢病毒載體包裝的慢病毒感染激活的T細(xì)胞，使得RQR8與相應(yīng)的CAR在T細(xì)胞中表達(dá)。

Day5: 第二次細(xì)胞改造（TALEN介導(dǎo)的基因編輯）
將GMP級(jí)別的TALEN編碼的mRNA通過(guò)電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入到經(jīng)過(guò)第一次改造的T細(xì)胞中，使TALEN瞬時(shí)表達(dá)。

TALEN能夠識(shí)別和切割TRAC與CD52基因組DNA，形成的DNA雙鍵裂斷由非精準(zhǔn)的NHEJ修復(fù)方式修復(fù)從而導(dǎo)致TRAC與CD52基因的敲除。

Day6到Day17：細(xì)胞擴(kuò)增
在可控的培養(yǎng)系統(tǒng)中將細(xì)胞擴(kuò)增到10¹¹ cells左右。

Day18-19：細(xì)胞純化與分裝
使用抗體-磁珠偶聯(lián)的beads，分選純化出TCRαβ陰性的T細(xì)胞。（此為一個(gè)重要的放行標(biāo)準(zhǔn)）

細(xì)胞的分裝與凍存。每個(gè)產(chǎn)品一般都會(huì)有2-3種劑量形式，用以滿足可能的劑量遞增需求。

UCART的QC標(biāo)準(zhǔn)
雖然現(xiàn)在還沒(méi)有詳盡的法規(guī)來(lái)規(guī)定CART產(chǎn)品的QC標(biāo)準(zhǔn)，但是CART產(chǎn)品還是需要一系列的質(zhì)量檢測(cè)。其中產(chǎn)品的純度，即≥97%的TCRαβ陰性細(xì)胞是一個(gè)重要的放行標(biāo)準(zhǔn)。此外產(chǎn)品的無(wú)菌性，內(nèi)毒素，支原體，以及是否含有可復(fù)制的慢病毒都需要進(jìn)行一系列檢測(cè)。產(chǎn)品對(duì)于目標(biāo)細(xì)胞的響應(yīng)（包括相關(guān)細(xì)胞因子的釋放與細(xì)胞殺傷活性）也應(yīng)該被檢測(cè)。

▲ UCART的QC標(biāo)準(zhǔn)

UCART19與UCART123臨床結(jié)果
在2017年12月的ASH會(huì)議上，Cellectis公布了UCART19的兩個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果。在CALM (UCART19 in Advanced Lymphoid Malignancies)劑量爬坡實(shí)驗(yàn)中，6名成人R/R B-ALL患者接受了低劑量的UCART19治療，該劑量為自體型CART實(shí)驗(yàn)中劑量的1/10。實(shí)驗(yàn)中UCART19顯示出了可控的安全性和較好的緩解率，只有一名出現(xiàn)了1級(jí)的GvHD。所有的6名患者都出現(xiàn)了細(xì)胞因子釋放風(fēng)暴（CRS），其中5人為輕度的1-2級(jí)，但能夠通過(guò)IL6R抑制劑tocilizumab克服；其中一名患者出現(xiàn)了4級(jí)CRS和敗血癥，并在第15天后死亡。另外的兩個(gè)高劑量會(huì)在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。在PALL(Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia)實(shí)驗(yàn)中，5名患兒接受了固定劑量的UCART19（2x10⁷ total cells or 1.1 to 2.3x10⁶ cells/kg），所有患兒都在4-8天都出現(xiàn)了1-3級(jí)的細(xì)胞因子釋放CRS，但是是可以克服的。在第28天，所有的患兒都取得了完全的緩解，但是在3個(gè)月后，兩個(gè)患兒復(fù)發(fā)，并且分別在第7個(gè)月和第八個(gè)月死亡。另一個(gè)患兒死于血栓性微血管病，腎炎等移植并發(fā)癥。剩下的兩個(gè)患兒目前分別在移植2個(gè)月和2.5個(gè)月的緩解期。

然而UCART123的臨床實(shí)驗(yàn)頗為不順，在2017年9月UCART123在治療BPDCN一期臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)了一例病人死亡，該病人在第8天經(jīng)歷了5級(jí)的CRS和4級(jí)的CLS，并在第9天死亡。在UCART123在治療AML的一期臨床試驗(yàn)中，一位病人在第9天經(jīng)歷了3級(jí)的CRS和4級(jí)的CLS，但最終脫離了生命危險(xiǎn)。目前UCART123的兩個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被FDA叫停。UCART123的安全性問(wèn)題可能出在靶點(diǎn)CD123上，由于CD123雖然在腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)，但正常細(xì)胞也有表達(dá)。強(qiáng)生和Genmab的CD123/CD3雙特異抗體JNJ63709178去年發(fā)生一例嚴(yán)重毒副反應(yīng)，臨床試驗(yàn)被暫時(shí)叫停。Stemline的免疫毒素（CD123/白喉毒素）年初也在一個(gè)BPDCN臨床試驗(yàn)中造成三例CLS死亡事件。

安全性問(wèn)題一直是CAR-T細(xì)胞治療中的重中之重，2017年JUNO的CAR-T產(chǎn)品就因?yàn)槌霈F(xiàn)兩次病人死亡情況被FDA叫停，從而被Novartis和Kite超越。而對(duì)于通用型CART，其面臨的安全性問(wèn)題壓力更大，UCART123被叫停，UCART19雖然還未出現(xiàn)與產(chǎn)品相關(guān)的嚴(yán)重副作用，但是臨床試驗(yàn)中也出現(xiàn)了多名患者死亡。因此，通用型CAR-T的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以及臨床實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的CRS等都應(yīng)該被小心對(duì)待。

CRISPR/Cas9與T細(xì)胞編輯
CRISPR/Cas9是現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛，研究最深入的基因編輯工具。與TALENs和ZFNs相比，CRISRP/Cas9的精確性更高，能降低脫靶效應(yīng)帶來(lái)的副作用；設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，更利于規(guī)?；a(chǎn)。雖然Novartis和Juno早在2015年就開(kāi)始與CRISPR相關(guān)公司合作開(kāi)發(fā)下一代CAR-T產(chǎn)品，但是現(xiàn)在還沒(méi)有更多進(jìn)展更新被報(bào)道。采用CRISPR/Cas9編輯T細(xì)胞基因組是相當(dāng)困難的，CRISPR/Cas9的delievry方法主要包括慢病毒，腺病毒，AAV等病毒載體遞送，使用質(zhì)?；蛘吆颂呛说鞍識(shí)NP電轉(zhuǎn)，或者是使用編碼Cas9的mRNA與sgRNA共電轉(zhuǎn)。雖然使用質(zhì)粒DNA核轉(zhuǎn)能夠編輯T細(xì)胞基因，但是DNA核轉(zhuǎn)對(duì)于T細(xì)胞的毒性非常大，不利于T細(xì)胞編輯的大規(guī)模應(yīng)用。

在2015年，研究者們使用CRISPR首次成功編輯了T細(xì)胞，他們使用的是Cas9蛋白與sgRNA的RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)，其編輯效率能夠達(dá)到55%。隨后研究者們使用了編碼Cas9的mRNA與sgRNA共電轉(zhuǎn)，其編輯效率也能夠達(dá)到60%以上。雖然研究者們也成功使用了慢病毒，AAV等病毒載體遞送CRISRP/Cas9進(jìn)行T細(xì)胞編輯，但是其編輯效率很低。目前病毒載體在T細(xì)胞中效率低的原因還不得而知，可能的一個(gè)猜測(cè)是在T細(xì)胞中，需要快速大量的表達(dá)Cas9蛋白。

▲ 利用不同方法遞送CRISPR/Cas9進(jìn)行T細(xì)胞編輯

▲各種CRISRP/Cas9的遞送方式在編輯T細(xì)胞時(shí)的比較

T細(xì)胞編輯的一個(gè)挑戰(zhàn)是如何能在較短的時(shí)間窗口，完成高效的基因編輯。由于激活的T細(xì)胞比na?ve T細(xì)胞更容易接受外源的核酸與蛋白質(zhì)，但是多次刺激T細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭，腫瘤殺傷能力降低，因此在生產(chǎn)T細(xì)胞產(chǎn)品時(shí)需要優(yōu)化好實(shí)驗(yàn)步驟，以達(dá)到高效的編輯。目前比較通用的方法是在T細(xì)胞激活后的Day1，使用慢病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)CAR，在Day3和Day4使用RNPs或者編碼Cas9的mRNA與sgRNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)，最終得到的CART產(chǎn)品中能達(dá)到>70%的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與>60%的基因編輯效率。

此外，為了達(dá)到敲除多個(gè)基因的目的，使用多個(gè)sgRNA共轉(zhuǎn)T細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生較高的細(xì)胞毒性；使用Cas9 RNP多元復(fù)合物會(huì)降低細(xì)胞毒性，但是會(huì)損失一定的編輯效率。有研究者開(kāi)發(fā)了One-shot CRISPR system，將多個(gè)sgRNA組裝進(jìn)了CAR所在的慢病毒載體中，這樣就只需要在Day3單獨(dú)電轉(zhuǎn)Cas9的mRNA就能夠達(dá)到編輯的效果，從而減少多個(gè)共轉(zhuǎn)造成的細(xì)胞毒性。此外，如何提高慢病毒或者AAV遞送CRISPR/Cas9編輯T細(xì)胞的效率，也是降低通用型CART生產(chǎn)成本，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模的重要因素。

小結(jié)

安全性問(wèn)題一直是CAR-T細(xì)胞治療中的重中之重，通用型CAR-T面臨著更大的安全性考驗(yàn)。在能保證安全性的條件下，通用型CAR-T與自體型CAR-T相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)。希望Cellectis的UCART臨床實(shí)驗(yàn)帶來(lái)更多令人振奮的結(jié)果與信息，希望CRISPR/Cas9技術(shù)能在T細(xì)胞編輯上有更大地突破，也希望CAR-T巨頭和基因編輯公司的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，早日為我們帶來(lái)新一代的免疫細(xì)胞療法。

參考資料：
1. Cellectis公司官網(wǎng)資料
2. Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells，2017
3. Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for 'Off-the-Shelf' Adoptive T-cell Immunotherapies, 2015
4. A highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy, 2015
5. Multiplex Genome Editing to Generate Universal CAR T Cells Resistant to PD1 Inhibition, 2016
6. CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells, 2017

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