2018年11月26日，南方科技大學(xué)賀建奎副教授通過媒體宣布，11月在中國(guó)誕生了一對(duì)CCR5基因編輯的嬰兒，他認(rèn)為敲除CCR5基因會(huì)預(yù)防父親攜帶HIV病毒可能產(chǎn)生的感染。此事一經(jīng)宣布，在國(guó)內(nèi)外便引起了軒然大波，隨之而來的是公眾的諸多質(zhì)疑：

• 從科學(xué)層面，CCR5基因的敲除是否能確保孩子的健康極不明確，而該基因的已知以及其他未知功能的一并缺失，可能帶來的副作用難以判斷；

• 從技術(shù)層面，CRISPR技術(shù)在人胚胎研究中的安全性還有待于全面深入的探討，目前脫靶和基因型嵌合等技術(shù)障礙依然無法避免；

• 從倫理層面，對(duì)于CCR5基因的敲除并不能給這個(gè)原本健康的嬰兒帶來明顯的益處，卻要承擔(dān)未知風(fēng)險(xiǎn)。

由于上述諸多風(fēng)波，近年來外界對(duì)CRISPR基因編輯的評(píng)價(jià)一直是負(fù)面的，但CRISPR技術(shù)仍然是一個(gè)偉大的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，很多研究者和病人都寄希望于該技術(shù)。最近CRISPR基因編輯技術(shù)的應(yīng)用似乎朝著積極的方向發(fā)展，更多的報(bào)道不再是基因編輯濫用，而是利用CRISPR技術(shù)治療罕見病和惡性腫瘤，令人欣喜的是，諸多課題已通過臨床試驗(yàn)證明該技術(shù)可有效治療疾病。

2020年2月28日，頂尖學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》刊登了題為CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer（CRISPR工程改造的T細(xì)胞在難治性癌癥患者中的應(yīng)用）的一篇文章，論述了癌癥免疫療法的臨床試驗(yàn)（試驗(yàn)：NCT03399448）最新進(jìn)展。該研究數(shù)據(jù)涉及3名參與者，2名患有難治性晚期骨髓瘤（多發(fā)性骨髓瘤），1名患者患有難治性轉(zhuǎn)移性肉瘤，且對(duì)之前的多種治療無有效反應(yīng)。經(jīng)過CRISPR-Cas9編輯的新型T細(xì)胞免疫療法的治療，編輯后的 T細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月，未出現(xiàn)任何嚴(yán)重不良事件，CRISPR用于癌癥治療安全性過關(guān)。

而且，令人鼓舞的是，這是美國(guó)首次在癌癥患者身上測(cè)試基于CRISPR基因編輯手段改造的T細(xì)胞免疫療法，此研究為細(xì)胞療法安全有效地應(yīng)用在腫瘤治療領(lǐng)域鋪平了道路，為被癌癥所困的患者帶來了無限希望。

下面讓我們由淺入深剖析下這篇來自《科學(xué)》的文章，了解下癌癥治療的前沿技術(shù)。

該篇文章的通訊作者Carl June教授，是CAR-T細(xì)胞療法創(chuàng)始人之一，被稱為“CAR-T之父”。2011年，Carl June的團(tuán)隊(duì)用這種療法成功治愈了一名急性白血病復(fù)發(fā)的小女孩艾米麗，使其成為世界首例通過該療法治愈癌癥的臨床病人，堪稱醫(yī)學(xué)界的奇跡。

CAR-T療法被證實(shí)在血液瘤領(lǐng)域（如白血病、淋巴瘤等）有較好的治療效果后，團(tuán)隊(duì)又把這一療法向?qū)嶓w瘤領(lǐng)域推進(jìn)。如今，基因修飾的T細(xì)胞免疫療法在實(shí)體腫瘤中也取得了令人矚目的成就。相信該技術(shù)在他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如自身免疫所引起的一些疾病（如糖尿病、骨質(zhì)疏松），也會(huì)大放異彩。

Ｔ細(xì)胞作為人體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，保護(hù)著我們免受各種疾病侵?jǐn)_。它們通過其特有的表面受體TCR (T cell receptor) 與病變的細(xì)胞上主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex, MHC) 所遞呈的抗原相結(jié)合，從而識(shí)別異己，發(fā)生反應(yīng)。

然而，在實(shí)際上大部分癌癥病例中，腫瘤細(xì)胞都可能會(huì)下調(diào)自身MHC遞呈的腫瘤相關(guān)性抗原或者下調(diào)MHC的表達(dá)，以躲避Ｔ細(xì)胞的追蹤；或者通過一些免疫抑制因子降低病人的整體免疫力，最終達(dá)成免疫逃避。這使得在體外對(duì)Ｔ細(xì)胞進(jìn)行重編程或基因工程改造成為必然的趨勢(shì)。

第三代基因編輯技術(shù)——CRISPR-Cas 9是繼鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,  ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALENs)之后的又一個(gè)如日中天的基因編輯工具。

CRISPR-Cas 9技術(shù)的興起彌補(bǔ)了ZFN和TALEN的多種不足，其同時(shí)具備了設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、靶向高效、適用廣泛和成本低廉等優(yōu)勢(shì)，而人們持續(xù)不斷地深入研究和優(yōu)化使之成為推向臨床使用的極具潛力的一項(xiàng)利器。

1. 從患者身上采集T細(xì)胞；

2. 使用Cas9-RNPs電穿孔T細(xì)胞，靶向處理內(nèi)源性TCR和PD-1的編碼基因；

3. 使用CRISP-Cas9敲除編碼內(nèi)源性T細(xì)胞受體（TCR）鏈的基因TCRα和TCRβ，以及編碼PD-1蛋白的基因；

4. 使用慢病毒載體為工程化TCR提供識(shí)別NY-ESO-1的基因；

5. 工程化的T細(xì)胞表達(dá)NY-ESO-1 TCR；

6. 將多次編輯的T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。

• 敲除TCR：內(nèi)源性TCR(T-cell receptor，一種癌細(xì)胞識(shí)別蛋白)與改造后的TCR（TCRα和TCRβ）相互競(jìng)爭(zhēng)，干擾信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞運(yùn)輸。敲除2個(gè)編碼內(nèi)源性T細(xì)胞受體（TCR）鏈的基因TCRα和TCRβ，可以減少TCR配錯(cuò)，改善工程性T細(xì)胞的功能和持久性。

• 敲除PD-1：T細(xì)胞的活性由于程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）受體的存在會(huì)出現(xiàn)自然下調(diào)。對(duì)患者PD-1的抑制作用可增強(qiáng)T細(xì)胞活性，但通常會(huì)引發(fā)不良的自身免疫反應(yīng)。故敲除編碼PD-1蛋白的基因，可提高安全性和減少自身免疫所致毒性。

• 插入NY-ESO-1：接著利用慢病毒插入一個(gè)親和力被增強(qiáng)的T細(xì)胞受體基因，使得被基因編輯的T細(xì)胞可靶向癌細(xì)胞上名為NY-ESO-1的抗原。NY-ESO-1的作用相對(duì)于”探頭”，可以用來靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞，追蹤工程化T細(xì)胞以監(jiān)測(cè)其功效。

研究人員用CRISPR技術(shù)敲除了T細(xì)胞內(nèi)的3個(gè)基因：分別是2個(gè)編碼內(nèi)源性T細(xì)胞受體（TCR）鏈的基因TCRα和TCRβ，以及編碼PD-1蛋白的基因。插入了1個(gè)基因：NY-ESO-1（癌癥-睪丸抗原，是一種特異性強(qiáng)，而毒副作用弱的靶標(biāo)抗原）。因此改造后的T細(xì)胞命名為NYCE (NY-ESO-1 transduced CRISPR 3X edited cells)。最終，經(jīng)過4次編輯的T細(xì)胞被回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。

• 經(jīng)過Crispr-cas 9 技術(shù)多次編輯的T細(xì)胞是安全的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三位患者并未出現(xiàn)明顯的免疫排斥反應(yīng)和與工程化T細(xì)胞相關(guān)的毒性反應(yīng)。雖然T細(xì)胞編輯過程中，在體外觀察到染色體易位，但在輸注給患者后隨著時(shí)間的推移而減少。

CRISPR-Cas9工程化T細(xì)胞并未引起嚴(yán)重的副作用

• 經(jīng)過Crispr-cas 9 技術(shù)多次編輯的T細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間更久。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過精準(zhǔn)編輯的T細(xì)胞，以穩(wěn)定的水平移植到三位患者體內(nèi)后，在最長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，患者體內(nèi)仍可以檢測(cè)到經(jīng)過基因編輯的工程化T細(xì)胞。此次實(shí)驗(yàn)T細(xì)胞存活持續(xù)時(shí)間較之前的臨床試驗(yàn)都長(zhǎng)。

CRISPR-Cas9工程化T細(xì)胞在3名患者體內(nèi)持續(xù)擴(kuò)增和存活

• 經(jīng)過Crispr-cas 9 技術(shù)多次編輯的T細(xì)胞表現(xiàn)了持續(xù)的攻擊和殺死腫瘤的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：從患者體內(nèi)分離出經(jīng)基因編輯的T細(xì)胞，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查仍有殺死癌細(xì)胞的能力。骨髓和腫瘤的活檢結(jié)果均顯示T細(xì)胞靶向定位腫瘤部位發(fā)揮免疫作用。盡管腫瘤活檢顯示有部分殘留，但在兩名骨髓瘤患者中，靶抗原NY-ESO-1和/或LAGE-1均減少。該結(jié)果與工程化T細(xì)胞的靶向作用一致，說明工程T細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)了殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。

患者的腫瘤縮小情況（紅色為腫瘤區(qū)域）

同期發(fā)表在《科學(xué)》雜志的另一篇題為Knocking out barriers to engineered cell activity的文章，對(duì)此次臨床試驗(yàn)給予了充分的肯定，但同時(shí)也提出來可能存在的潛在問題。

• 目前尚不清楚Cas9編輯的細(xì)胞到底是否具有免疫原性，以及殘留的Cas9（一種細(xì)菌蛋白）是否會(huì)觸發(fā)免疫反應(yīng)。臨床試驗(yàn)的三名患者沒有表現(xiàn)出明顯的免疫排斥與NYCE細(xì)胞毒性，但是研究過程中三位患者體內(nèi)針對(duì)于Cas9蛋白，而預(yù)先存在的T細(xì)胞和抗體滴度并未比基線增加。

• 此次試驗(yàn)使用CRISPR-Cas9對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行了多次精準(zhǔn)編輯，以實(shí)現(xiàn)最小的脫靶率。有30%的T細(xì)胞的3個(gè)靶序列均沒有發(fā)生突變，但40%發(fā)生了1個(gè)突變，10-20%發(fā)生了雙突變和三突變。在輸注后的第10天到4個(gè)月之間，T細(xì)胞的序列一直比較穩(wěn)定，4個(gè)月之后，約有40%的外周血液中的T細(xì)胞可以檢測(cè)到任一靶基因處發(fā)生了突變。

• 這項(xiàng)研究仍未解決的最大問題是，CRISPR編輯的工程化T細(xì)胞是否對(duì)晚期癌癥有效。1期臨床試驗(yàn)評(píng)估了NYCE細(xì)胞的安全性，但未評(píng)估其治療癌癥的功效。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，一名參與者因癌癥而死亡，另外兩名正在接受其他療法。

對(duì)于此次臨床試驗(yàn)，CRISPR先驅(qū)Jennifer Doudna博士表示：“這是在患者中使用CRISPR-Cas9基因組編輯的道路上邁出的重要一步，顯示了這項(xiàng)技術(shù)成為一種安全有效療法的潛力，為下一代細(xì)胞療法鋪平道路?！?/p>

盡管其他類型的基因編輯體細(xì)胞（例如干細(xì)胞）的安全性尚待確定，但令人鼓舞的是，有研究結(jié)果顯示首批注入CRISPR-Cas9修飾細(xì)胞的β-地中海貧血和鐮狀細(xì)胞性貧血患者，其身體產(chǎn)生了健康血液。 

相信未來還會(huì)有其他基于基因編輯的療法被證明是安全有效的，到那時(shí)，更多的研究精力會(huì)被集中到細(xì)胞的生產(chǎn)和管理，以及成本問題上，讓越來越多的患者能夠受益于基因編輯。

癌癥治療的研究一直是數(shù)年來的科學(xué)難題, 受限于癌癥發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性, 以及腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn), 使得癌癥的治療往往出現(xiàn)易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。腫瘤的免疫治療近來備受關(guān)注，包括重組抗原疫苗、基因編輯T細(xì)胞、溶瘤病毒和免疫檢查點(diǎn)阻斷治療等。

基因編輯的工程化T細(xì)胞是目前最具革命性的癌癥治療手段。區(qū)別以往傳統(tǒng)的化學(xué)療法、放射性療法以及藥物靶向性療法，該方法不直接作用于腫瘤本身使腫瘤細(xì)胞死亡，而是作用于病人自身的免疫系統(tǒng)，刺激并增強(qiáng)其對(duì)腫瘤的再識(shí)別與殺傷能力，因此在多種腫瘤中都具有一定的適用性。

近兩年來, 對(duì)于T細(xì)胞進(jìn)行武裝增強(qiáng)免疫原性, 加強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)于腫瘤的殺傷力, 已經(jīng)取得了重大的進(jìn)展。文中的介紹的CRISPR-cas9編輯的T細(xì)胞已進(jìn)入了臨床階段，用于治療其他方法無效的晚期癌癥，并初步證實(shí)了方法的可行性，這無疑是癌癥治療路上的又一道曙光，給人以無限的鼓舞。

雖然基因編輯的工程T細(xì)胞仍然存在基因脫靶、安全性、有效性等方面的諸多問題，但是毫無疑問，這是CRISPR基因編輯和細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用的重要一步。期待在不久的將來，基因編輯技術(shù)可以打破重重壁壘，拓展到癌癥治療的更廣范圍，造福于更多的癌癥患者。

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