2019年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎在瑞典卡洛琳斯卡醫(yī)學(xué)院揭曉，授予哈佛醫(yī)學(xué)院的William G.Kaelin,牛津大學(xué)的Peter J.Ratcliffe以及約翰霍普金斯大學(xué)的Gregg L.Semenza.，以表彰他們在低氧感應(yīng)方面（'for their discoverys of how cells sense and adapt to oxygen availability'）做出的貢獻(xiàn)。值得一提的是，這三位科學(xué)家2016年曾獲得拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎。人類和哺乳動物感知氧氣的重要性自不必多說，在不同氧氣濃度下，細(xì)胞會做出精細(xì)反應(yīng)并進(jìn)行適應(yīng)性的調(diào)節(jié)，揭示細(xì)胞感知氧的分子機制為包括腫瘤、心血管病、黃斑退行性病變等多種疾病的臨床治療開辟了新路徑。
2016年的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎授予William G.Kaelin、Peter J.Ratcliffe和Gregg L.Semenza之后，Cell雜志邀請了腫瘤代謝的知名專家Craig B.Thompson教授專門撰寫了題為Into Thin Air: How We Sense and Respond to Hypoxia的文章介紹他們的重要發(fā)現(xiàn)【1】。這篇Cell文章提到，三位科學(xué)家是分別獨立展開的系列工作。整個工作的源頭還要從關(guān)鍵的促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,EPO）說起。人類和哺乳動物的體內(nèi)需要紅細(xì)胞作為氧氣載體然后輸送到全身，而如果氧氣缺乏或貧血會導(dǎo)致來源于腎臟分泌的EPO刺激骨髓生成新的紅細(xì)胞，從而提高氧氣的運輸能力（注：人源EPO是1977年被純化出來，文章發(fā)表在JBC上【2】）。盡管很早就知道EPO刺激紅細(xì)胞生產(chǎn)，但是細(xì)胞如何感應(yīng)氧氣從而調(diào)控EPO的表達(dá)呢？三位獲獎人的工作正是回答了上述重要問題。接下來，我們逐步回顧一下各個重要的發(fā)現(xiàn)歷程。1991年，Gregg L.Semenza作為第一作者在PNAS發(fā)表題為Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3' to the human erythropoietin gene的論文（諾獎委員會的第1篇參考文獻(xiàn)）【3】，Semenza等人通過DNase I超敏感位點研究（當(dāng)某基因處于活躍轉(zhuǎn)錄狀態(tài)時，含有這個基因的區(qū)域?qū)τ诿撗鹾颂呛怂崦窪Nase I的敏感性要比無轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域高百倍以上）找到了4個或者多個不同的核因子，發(fā)現(xiàn)至少有兩個是在肝臟和腎臟的貧血或缺氧條件下誘導(dǎo)的，這些結(jié)果對于隨后找到關(guān)鍵的低氧誘導(dǎo)因子具有重要的意義，這種因子當(dāng)時就被命名為“Hypoxia-inducible factors”【3】。隨后就是如何去尋找鑒定當(dāng)時所謂的Hypoxia-inducible factors了。Gregg Semenza. IMAGE CREDIT: JOHNS HOPKINS MEDICINE諾獎委員會的press release中主要提了1995年的PNAS（諾獎委員會的第2篇參考文獻(xiàn)），這篇文章主要確定了HIF-1包含兩個蛋白的序列：HIF-1α和HIF-1β，分析了蛋白的結(jié)構(gòu)域，并且比較果蠅中的同源蛋白Per和Sim【4】。事實上，在1991年和1995年分別發(fā)表的PNAS文章的期間，Semenza和華人學(xué)生Guang L. Wang一起還發(fā)表了大量相關(guān)的工作，包括1993年發(fā)表在JBC上的文章（被引超過1000次）主要描述了HIF-1與DNA結(jié)合的活性相關(guān)研究【5】，而1993年PNAS論文則是證明了HIF-1在低氧誘導(dǎo)的情況下識別序列在不同類型的哺乳細(xì)胞中具有一致性【6】。事實上，1995年一月份發(fā)表在JBC上的論文（被引超過2100次）【7】也非常重要，這篇文章主要分離純化和鑒定了HIF-1，明確提出HIF-1主要以異二聚體形式存在，主要由120 kDa的HIF-1α和91-94 kDa的HIF-1β組成【7】。Semenza等繼續(xù)對HIF-1進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α還能夠誘導(dǎo)在血管生成中起重要作用的血管內(nèi)皮生長因子VEGF（ vascular endothelial growth factor ）【8】，這表明HIF-1α作為氧傳感的核心因子對調(diào)控血管系統(tǒng)的生成也具有重要意義，相關(guān)工作1996年發(fā)表在MCB雜志上（被引3900多次）【8】。1998年，Semenza等發(fā)表在Gene & Dev上的而研究則是通過制備HIF-1α突變的轉(zhuǎn)基因小鼠確定其體內(nèi)生物學(xué)功能，研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α功能缺失的情況下，血管發(fā)育和氧依賴性基因的表達(dá)收到嚴(yán)重?fù)p害，而且導(dǎo)致胚胎致死【9】（被引近2500次）。
接下來談?wù)?span>Peter J.Ratcliffe的主要貢獻(xiàn)。時間回到1993年。Ratcliffe組1993年發(fā)表在PNAS雜志上的工作【10】，利用瞬時基因轉(zhuǎn)染的報告基因系統(tǒng)偶聯(lián)到促紅細(xì)胞生成素基因EPO 3'的轉(zhuǎn)錄增強子，結(jié)果顯示了氧氣感知系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中廣泛存在，而不限于腎臟和肝臟細(xì)胞亞群，這篇文章和Semenza組1993年的PNAS工作結(jié)論有些相似之處。隨后，1994年Ratcliffe組繼續(xù)在PNAS雜志上發(fā)表論文【11】，這篇文章的主要意義在于，該研究發(fā)現(xiàn)了在低氧誘導(dǎo)情況下，糖酵解過程中的重要基因磷酸甘油酸激酶PGK（phosphoglycerate kinase）和乳酸脫氫酶LDHA（ lactate dehydrogenase A）也出現(xiàn)了類似EPO基因被誘導(dǎo)表達(dá)的情況。這個研究的意義在于，HIF-1不僅僅在機體水平上負(fù)責(zé)調(diào)控缺氧的適應(yīng)，而且在細(xì)胞水平上參與調(diào)解糖酵解的速率。事實上，現(xiàn)在關(guān)注腫瘤代謝研究的同行大多了解，HIF-1和c-Myc還有p53共同構(gòu)成了調(diào)控糖酵解的核心轉(zhuǎn)錄因子（下圖）【12】。c-Myc、 HIF1 和 p53 對糖酵解代謝途徑的調(diào)控。圖片引自【12】下面再來談?wù)劦谌猾@獎人William G.Kaelin。Craig B.Thompson教授撰寫的文章中談到，Kaelin與專門做基礎(chǔ)研究的Semenza和Ratcliffe不同，他是一位臨床醫(yī)生。Kaelin有著較好的臨床訓(xùn)練，他主要研究一種遺傳綜合征，即von Hippel-Lindau病（VHL病，常染色體顯性遺傳性癌癥易感性綜合征）。這種遺傳疾病會導(dǎo)致遺傳性VHL突變的家庭罹患某些癌癥的風(fēng)險急劇增加。1995年，Kaelin等人在Science上發(fā)表論文【13】，報道了VHL與Elongin B、Elongin C和CUL2形成復(fù)合物，該工作暗示了VHL/Elongin/CUL2復(fù)合物有可能起到泛素連接酶的作用，該工作為后續(xù)Ratcliffe小組1999年的Nature提供了重要的參考信息。1996年（HIF-1正式被鑒定后的第二年），Kaelin等人發(fā)表在PNAS上的研究表明，VHL蛋白可以通過氧依賴的蛋白水解作用負(fù)性調(diào)節(jié)HIF【14】，而1999年Ratcliffe小組在Nature（諾獎委員會的第3篇參考文獻(xiàn)）上的工作進(jìn)一步確定了VHL蛋白是一個蛋白復(fù)合物的成分之一，這個蛋白復(fù)合物和SCF（Skp1/Cdc53 or Cullin/F-box）這一大類泛素連接酶非常相似，正是由于VHL功能缺失導(dǎo)致了HIF蛋白不能被降解【15】，因此HIF蛋白的靶基因上調(diào)，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。在搞清楚了VHL降解HIF-1蛋白之后，接著又有新的問題出現(xiàn)，在有氧氣的情況下，VHL如何降解HIF-1呢？也就是說，有什么氧特意依賴的方式降解HIF-1。2001年，Kaelin組和Ratcliffe以“背靠背”的形式在Science雜志上發(fā)表論文（諾獎委員會的第4和第5篇參考文獻(xiàn)）【16,17】，研究發(fā)現(xiàn)了HIF-1α在氧氣存在的情況下多肽上的脯氨酸進(jìn)行了羥基化作用，而且VHL正是特異性的結(jié)合了羥基化的HIF-1α，才導(dǎo)致了HIF-1α被降解。接著問問題，是什么因素控制HIF-1α發(fā)生氧依賴性的羥化反應(yīng)？2001年，Ratcliffe組在Cell，Steve McKnight組在Science，Kaelin組先后在PNAS分別獨立報道了催化HIF-1α發(fā)生羥化反應(yīng)的酶【18-20】。此外，2002年發(fā)表在Gene & Dev上的工作還表明發(fā)生在天冬氨酸殘基上的羥化反應(yīng)可以阻止HIF-1α招募轉(zhuǎn)錄共激活因子【21】，事實上這是給HIF-1α上的雙保險，保證細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α充分被降解。整個氧感知的機制發(fā)現(xiàn)歷程到這里基本上差不多了。最后，談點個人感受，從本文所引用的參考文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，PNAS雜志是最大的贏家，事實上到后期的一些發(fā)表在CNS上的工作盡管也非常重要的，但是從原創(chuàng)性上講屬于“馬后炮”了，早期的一篇重要JBC也特別值得關(guān)注。筆者從諾獎開獎之時起臨時準(zhǔn)備稿件，差不多用了3個半小時了，希望這個梳理對大家深入了解整個氧感知的研究歷程有清晰的認(rèn)識，時間匆忙，文章中的疏漏和訛誤之出在所難免，敬請讀者諒解。這篇文章算是對這個國慶長假的紀(jì)念！Peter J. Ratcliffe在接到電話時正在寫基金。William G.Kaelin,Jr.正獨自在家。1、Thompson, C. B. (2016). Into thin air: How we sense and respond to hypoxia. Cell, 167(1), 9-11.2、Miyake, T., Kung, C. K., & Goldwasser, E. (1977). Purification of human erythropoietin. Journal of Biological Chemistry, 252(15), 5558-5564.3、Semenza, G.L, Nejfelt, M.K., Chi, S.M. & Antonarakis, S.E. (1991). Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3’ to the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA, 88, 5680-56844、Wang, G.L., Jiang, B.-H., Rue, E.A. & Semenza, G.L. (1995). Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 5510-55145、Wang, G. L., & Semenza, G. L. (1993). Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia. Journal of Biological Chemistry, 268(29), 21513-21518.6、Wang, G. L., & Semenza, G. L. (1993). 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