微生物鑒定之生化實(shí)驗(yàn)大全

不同的細(xì)菌具有各自的獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不相同。這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生物化學(xué)特性，可利用生物化學(xué)的方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌。掌握各種生化反應(yīng)的原理和應(yīng)用是細(xì)菌鑒定的基礎(chǔ)。生理生化特性的測(cè)定主要根據(jù)Shirling＆Gottlieb《International Journal of Systematic Bacteriology》中鑒定的有關(guān)試驗(yàn)。

（一）碳水化合物代謝實(shí)驗(yàn)：

糖（醇、苷）類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

（1）原理：細(xì)菌分解糖的能力與該菌是否含有分解某種糖的酶密切相關(guān)，故分解糖的能力各不相同，細(xì)菌分解糖類后的終產(chǎn)物亦不一致，在含糖培養(yǎng)基中加入指示劑，若細(xì)菌分解糖則產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使培養(yǎng)基顏色改變，從而判斷細(xì)菌是否分解某種糖或其他碳水化合物。

（2）基本培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入0.5%-1%的糖類（單糖、雙糖、或者多糖）、醇類（甘露醇、肌醇）苷類（水楊苷、菊糖等）。培養(yǎng)基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：取某一種細(xì)菌的24h純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果并記錄。

（4）結(jié)果判定

如果接種進(jìn)去的細(xì)菌可發(fā)酵某種糖或醇，則可產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基由紫色變成黃色，如果不發(fā)酵，則仍保持紫色。如發(fā)酵的同時(shí)又產(chǎn)生氣體，則在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。

（5）應(yīng)用：是鑒定細(xì)菌最主要最基本的實(shí)驗(yàn)，特別是對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要。

氧化型與發(fā)酵型(O/F)的測(cè)定

（1）原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，必需有氧的參加的，稱為氧化型，細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，可以進(jìn)行無(wú)氧降解的，稱為發(fā)酵型。發(fā)酵型細(xì)菌無(wú)論在有氧或者無(wú)氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。這在區(qū)別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。

（2）培養(yǎng)基：培養(yǎng)基蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，葡萄糖10g，瓊脂3g，1％溴麝香草酚藍(lán)3mL，蒸餾水1000mL。將蛋白胨、鹽、瓊脂和水混合，加熱溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示劑，加熱溶解；分裝試管，3～4mL/管；115℃，高壓蒸汽滅菌20min，取出后冷卻成瓊脂柱。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：挑取18～24h的幼齡斜面培養(yǎng)物，穿刺接種，每種細(xì)菌接種兩管，于其中1管覆蓋1mL滅菌的液體石蠟，37℃培養(yǎng)24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。

（4）結(jié)果判定。

β一半乳糖苷(ONPG)實(shí)驗(yàn)

（1）原理：有的細(xì)菌可以產(chǎn)生β一半乳糖苷酶，能分解鄰－硝基酚－β－D－半乳糖苷，而生成黃色的鄰－硝基酚，在很低濃度下也可以檢測(cè)出。

（2）培養(yǎng)基：鄰硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0．01mol／L pH7．5磷酸緩沖液1 000mL，pH 7．5的滅菌1％蛋白胨水300mL。先將前兩種成分混合溶解，過(guò)濾除菌，在無(wú)菌條件下與1％蛋白胨水混合，分裝試管，每管2～3mL，無(wú)菌檢驗(yàn)后備用。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：取一環(huán)細(xì)菌純培養(yǎng)物接種在ONPG培養(yǎng)基上置37℃培養(yǎng)1～3h或24h，如有β－半乳糖苷酶，會(huì)在3h內(nèi)產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚；如無(wú)此酶，則在24h內(nèi)不變色。

七葉苷水解實(shí)驗(yàn)

（1）原理：有的細(xì)菌可以將七葉苷分解為七葉素和葡萄糖，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子反應(yīng)，生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基呈黑色。

（2）應(yīng)用：主要用于腸球菌與其它鏈球菌的鑒別，前者陽(yáng)性，后者陰性，也可用于革蘭氏陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。

甲基紅實(shí)驗(yàn)

（1）原理：細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)酸，當(dāng)產(chǎn)酸量大，使培養(yǎng)基的pH降至4．5以下時(shí)，加入甲基紅指示劑而變紅，為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。若細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如醇、酮、醛、氣體和水等）則培養(yǎng)基的PH值仍在PH6.2以上，故加入甲基紅試劑呈黃色，為陰性。

（2）實(shí)驗(yàn)方法：一種細(xì)菌的24h培養(yǎng)物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)48～72h，取出后加甲基紅試劑3～5滴，凡培養(yǎng)液呈紅色者為陽(yáng)性，橙色者為可疑，黃色者為陰性。

（3）應(yīng)用：主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽(yáng)性后者為陰性。

V-P實(shí)驗(yàn)

（1）原理：有些細(xì)菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸, 丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精氨酸所含的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色的化合物。若培養(yǎng)基中的胍基含量過(guò)少，則可加入少量含胍基的化合物等。

（2）V-P 試劑：肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：接種實(shí)驗(yàn)菌于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(與甲基紅實(shí)驗(yàn)相同)中，每次兩個(gè)重復(fù)，置適溫培養(yǎng)2-6d，取培養(yǎng)液和40%NaOH等量相混，加入少許肌酸，10min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，有時(shí)需要放置更長(zhǎng)時(shí)間才出現(xiàn)紅色反應(yīng)。

（4）應(yīng)用：本實(shí)驗(yàn)常與甲基紅實(shí)驗(yàn)一起用，因?yàn)榍罢哧?yáng)性的細(xì)菌，后者通常為陰性。

(二) 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝實(shí)驗(yàn)

明膠液化實(shí)驗(yàn)

（1）原理： 某些可以產(chǎn)生一種胞外蛋白水解酶(明膠酶)，能使明膠分解為氨基酸，使明膠失去凝固能力而液化，因而使半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動(dòng)的液體。

（2）實(shí)驗(yàn)方法： 取18-24h的斜面培養(yǎng)物穿刺接種，并有兩支未接種的空白對(duì)照。

 (3) 結(jié)果觀察：于30℃培養(yǎng)20天后觀察，明膠液化的為陽(yáng)性。由于室溫下明膠培養(yǎng)基呈液狀，因此在觀察結(jié)果時(shí)，應(yīng)將其放置于4℃的冰箱中30分鐘后拿出觀察。若明膠仍能全部凝固，為陰性，有部分或全部不能凝固為陽(yáng)性。

吲哚實(shí)驗(yàn)

（1）原理：某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當(dāng)加入吲哚試劑(對(duì)二甲氨基苯甲醛)后則形成紅色的玫瑰吲哚。

（2）培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃孵育24~48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑，觀察結(jié)果。

（4）結(jié)果：于兩液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。

（5）應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。

硫化氫試驗(yàn)

（1）原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇亞鐵離子或鉛離子則結(jié)合形成黑色沉淀物(硫化鐵或硫化鉛沉淀)。

（2）實(shí)驗(yàn)方法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中，于35℃孵育24h -48h，觀察有無(wú)黑色沉淀出現(xiàn)。

（3）結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮浴?/p>

（4）應(yīng)用：主要用于鑒別腸桿菌科中屬及種的鑒別，如沙門(mén)菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛(ài)德華菌屬等為陽(yáng)性，其它菌屬大多為陰性。但沙門(mén)菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺(tái)、豬霍亂沙門(mén)菌等。

尿素分解試驗(yàn)

（1）原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。

（2）培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35℃孵育18~24h小時(shí)觀察結(jié)果。

（4）結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮浴?/p>

（5）應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽(yáng)性，另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽(yáng)性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。

苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)

（1）原理：測(cè)定細(xì)菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細(xì)菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。

（2）培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。

（3） 實(shí)驗(yàn)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h，滴加10% 三氯化鐵試劑3~4滴，自斜面上方流下。

（4）結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽(yáng)性。應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間會(huì)引起退色。

（5）應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽(yáng)性，腸桿菌科其它細(xì)菌均為陰性。

氨基酸脫羧酶試驗(yàn)

（1）原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來(lái)。

（2）培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對(duì)照培養(yǎng)基。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸(賴氨酸，鳥(niǎo)氨酸或精氨酸)脫羧酶試驗(yàn)管1支氨基酸脫羧酶對(duì)照管(無(wú)氨基酸)，各覆蓋至少12.5px高度的無(wú)菌石蠟油，35℃孵育1~4d，每日觀察結(jié)果。

（4） 結(jié)果：對(duì)照管應(yīng)為黃色，若為溴甲酚紫指示劑，則測(cè)定管呈紫色則為陽(yáng)性，若測(cè)定管呈黃色為陰性。若對(duì)照管呈現(xiàn)紫色則試驗(yàn)無(wú)意義，不能做出判斷。

（5） 應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。如沙門(mén)菌屬中除傷寒和雞沙門(mén)菌外，其余沙門(mén)菌的賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶均為陽(yáng)性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。

（三）碳源和氮源的利用實(shí)驗(yàn)

唯一碳源利用實(shí)驗(yàn)

（1）原理：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基只提供一種待檢測(cè)碳源，若菌株生長(zhǎng)則表明菌株能以此種碳源為唯一碳源，否則不能。

（2）培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基：(NH4)2HPO4 1 g；NaCl 1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；KH2PO4 0.5 g；瓊脂20 g；蒸餾水 1000 mL；pH 7.0-7.2。

各種碳源的終濃度如下：糖類及其衍生物(醇類，糖苷類等)：1%，w/v；多醇和甘油：1%，w/v； 苯甲酸鹽，二酸鹽，其它單酸鹽：0.1%，w/v。糖類及其衍生物和多醇要求過(guò)濾除菌，鹽類可加入培養(yǎng)基一起滅菌。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：將純的菌株接種到培養(yǎng)基后培養(yǎng)14~28d，觀察其生長(zhǎng)情況，以不加碳源的培養(yǎng)基作對(duì)照。能夠生長(zhǎng)為陽(yáng)性。

唯一氮源利用實(shí)驗(yàn)

（1）原理：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基只提供一種待檢測(cè)氮源，若菌株生長(zhǎng)則表明菌株能以此種氮源為唯一碳源，否則不能。

（2）培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基： D-Glucose 1 g；MgSO4·7H2O 0.05 g；NaCl 0.05 g；FeSO4·7H2O 0.001 g；KH2PO4 0.01 g。不同氮源按0.5%的濃度加入。

（3）實(shí)驗(yàn)方法：將純的菌株接種到培養(yǎng)基后培養(yǎng)14~28d，觀察其生長(zhǎng)情況，以不加氮源的培養(yǎng)基作對(duì)照。能夠生長(zhǎng)為陽(yáng)性。

（四）各種酶類實(shí)驗(yàn)

氧化酶試驗(yàn)

（1）原理：氧化酶(即細(xì)胞色素氧化酶)，是細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。因此，本試驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。

（2）實(shí)驗(yàn)方法：菌落法：直接滴加試劑于被檢菌落上；濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，蘸取菌少許，然后加試劑；試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。

（3）結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色，為陽(yáng)性。無(wú)色為陰性。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

（4）應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌和假單胞菌屬的鑒別，前者陰性，而后者陽(yáng)性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽(yáng)性反應(yīng)。

過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))

（1）原理：具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過(guò)氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。

（2）實(shí)驗(yàn)方法：取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3%過(guò)氧化氫數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果：若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽(yáng)性。無(wú)氣泡為陰性。

（4）應(yīng)用：革蘭陽(yáng)性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故該試驗(yàn)常用于革蘭陽(yáng)性球菌的初步分群。

硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)

（1）原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個(gè)過(guò)程：一是在合成代謝過(guò)程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其它含氮化合物；二是在分解代謝過(guò)程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽還原過(guò)程可因細(xì)菌不同而異。有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等；有的細(xì)菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌；有的細(xì)菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。

（2） 實(shí)驗(yàn)方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基(內(nèi)含小倒管)中，35℃孵育1~4d。將甲、乙等量混合液(用時(shí)混合)(約0.1ml)加于試管內(nèi)，立即觀察結(jié)果。

（3）結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性反應(yīng)。若加入試劑后無(wú)顏色反應(yīng)，可能是：①硝酸鹽沒(méi)有被還原，試驗(yàn)陰性；②硝酸鹽被還原為氨和氮等其他物質(zhì)而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，這時(shí)應(yīng)在試管內(nèi)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗(yàn)確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表明試驗(yàn)為假陰性。

若要觀察是否有氮?dú)猱a(chǎn)生，可于培養(yǎng)基管內(nèi)加1只小導(dǎo)管，有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮?dú)馍伞?/p>

（4）應(yīng)用：本試驗(yàn)廣泛用于細(xì)菌鑒定。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌屬均可產(chǎn)生氮?dú)?有些厭氧菌如韋榮菌等試驗(yàn)也為陽(yáng)性。

淀粉酶實(shí)驗(yàn)

（1）原理：有些細(xì)菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶，淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不在變藍(lán)。

（2）培養(yǎng)基：淀粉瓊脂培養(yǎng)基。

（3） 實(shí)驗(yàn)方法：在淀粉培養(yǎng)基上接種實(shí)驗(yàn)菌株后，30℃培養(yǎng)1-2周后將平板取出，滴加少量盧戈氏碘液于平板上。觀察菌苔周?chē)呐囵B(yǎng)基有無(wú)色透明圈出現(xiàn)。