單gRNA載體應(yīng)用于移碼或片段敲除

一、單 gRNA 載體在基因編輯中的作用

單 gRNA 載體在基因編輯領(lǐng)域扮演著關(guān)鍵角色，尤其在移碼或片段敲除操作中具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。gRNA（引導(dǎo) RNA）是 CRISPR - Cas9 基因編輯系統(tǒng)的重要組成部分，它能夠引導(dǎo) Cas9 蛋白識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)基因的特定序列上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的精確編輯。

二、移碼敲除中的應(yīng)用

（一）原理

在移碼敲除中，單 gRNA 載體引導(dǎo) Cas9 蛋白在目標(biāo)基因的編碼區(qū)制造雙鏈斷裂。細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)，通常通過非同源末端連接（NHEJ）進(jìn)行修復(fù)。由于 NHEJ 是一種易錯(cuò)的修復(fù)方式，在修復(fù)過程中可能會(huì)插入或缺失堿基，從而改變基因的閱讀框。這種閱讀框的改變會(huì)導(dǎo)致翻譯出的蛋白質(zhì)序列發(fā)生異常，往往會(huì)提前出現(xiàn)終止密碼子，使蛋白質(zhì)失去功能。

（二）設(shè)計(jì)要點(diǎn)

設(shè)計(jì)用于移碼敲除的單 gRNA 時(shí)，要選擇目標(biāo)基因編碼區(qū)合適的位置。一般而言，選擇靠近基因起始密碼子后的區(qū)域，這樣可以最大程度地影響蛋白質(zhì)的翻譯過程。同時(shí)，要確保 gRNA 的特異性，避免與其他非目標(biāo)基因序列發(fā)生交叉反應(yīng)，可通過生物信息學(xué)工具對(duì) gRNA 序列進(jìn)行脫靶效應(yīng)分析。

三、片段敲除中的應(yīng)用

（一）原理

對(duì)于片段敲除，單 gRNA 載體同樣引導(dǎo) Cas9 蛋白在目標(biāo)基因的特定位置產(chǎn)生雙鏈斷裂。如果在目標(biāo)基因中設(shè)計(jì)兩個(gè)或多個(gè)合適的 gRNA 靶向片段的兩端或關(guān)鍵區(qū)域，當(dāng)這些位點(diǎn)被切割后，細(xì)胞修復(fù)機(jī)制可能會(huì)導(dǎo)致中間片段的缺失?；蛘?，在某些情況下，單個(gè) gRNA 引導(dǎo)的切割結(jié)合特定的細(xì)胞修復(fù)環(huán)境和條件，也可能引發(fā)大片段的重排或缺失，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因特定片段的敲除。

（二）設(shè)計(jì)要點(diǎn)

當(dāng)使用單 gRNA 進(jìn)行片段敲除時(shí)，要對(duì)目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)和功能有深入了解。選擇靶向基因中包含關(guān)鍵調(diào)控元件或?qū)蚬δ苡兄匾绊懙耐怙@子等片段。gRNA 的設(shè)計(jì)要考慮到切割位點(diǎn)與片段邊界的關(guān)系，以提高片段敲除的成功率。同時(shí)，和移碼敲除一樣，要保證 gRNA 的特異性，減少對(duì)基因組其他部分的不必要編輯。

四、單 gRNA 載體應(yīng)用的優(yōu)勢與局限性

（一）優(yōu)勢

操作相對(duì)簡單：相較于使用多個(gè) gRNA 載體或復(fù)雜的基因編輯策略，單 gRNA 載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過程相對(duì)簡潔，降低了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和難度。

特異性較高：只要設(shè)計(jì)合理，單 gRNA 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)靶向，減少脫靶效應(yīng)帶來的潛在問題，有利于對(duì)基因編輯結(jié)果的準(zhǔn)確分析。

（二）局限性

編輯效率問題：在某些情況下，僅依靠單 gRNA 可能無法達(dá)到很高的編輯效率，特別是對(duì)于一些復(fù)雜基因組結(jié)構(gòu)或難以編輯的細(xì)胞類型。

片段敲除的不確定性：使用單 gRNA 進(jìn)行片段敲除時(shí)，結(jié)果可能存在一定的不確定性，因?yàn)榧?xì)胞修復(fù)機(jī)制的復(fù)雜性，可能無法完全按照預(yù)期實(shí)現(xiàn)特定片段的精確敲除。

齊岳小編axc