CRISPR/Cas 是進(jìn)行基因編輯的強(qiáng)大工具，可以對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)的精確編輯。在向?qū)?RNA（guide RNA， gRNA）和 Cas9 蛋白的參與下，待編輯的細(xì)胞基因組 DNA 將被看作病毒或外源 DNA，被精確剪切。

使用在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站 CRISPR direct，如需直接復(fù)制網(wǎng)址，可在生物學(xué)霸后臺(tái)對(duì)話框回復(fù) direct 即可。

靶點(diǎn)挑選要點(diǎn)：

1. 基因敲除靶點(diǎn)應(yīng)設(shè)計(jì)在起始密碼子附近（包括起始密碼子）或者起始密碼子下游的外顯子范圍內(nèi)。

   
   

2. 不同 Cas9/gRNA 靶點(diǎn)在基因敲除效率上有較大差異，因此同時(shí)設(shè)計(jì)構(gòu)建 2～3 個(gè)靶點(diǎn)的基因敲除載體再?gòu)闹羞x出敲減效果較佳的靶點(diǎn)。

   
   

3. N₁-N₂₀ NGG 靠近 PAM 的堿基對(duì)靶點(diǎn)的特異性很重要，前 7～12 個(gè)堿基的錯(cuò)配對(duì) Cas9 切割效率影響較小。設(shè)計(jì)好的靶點(diǎn)序列應(yīng)在基因庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 檢測(cè)。

   
   

   

   
   

4. Cas9Nicknase 需要挑選成對(duì)的靶點(diǎn)。一般在正義鏈和反義鏈上分別挑選相距 20～30bp 的靶點(diǎn)配對(duì)。多對(duì)靶點(diǎn)的敲除效率常有較大差異。由于基因敲除實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，在正式對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行敲除前對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證和挑選非常必要。

插入寡核苷酸序列設(shè)計(jì)（必須 PAGE 純化寡核苷酸）：

正向序列 

5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’

反向序列  

3’TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’

插入片段的合成

1. 用水將寡核苷酸稀釋為 100 μM。按以下體系配制退火反應(yīng)體系：

   
   

2. 正義寡核苷酸（100 μM）5μl

   
   

3. 反義寡核苷酸（100 μM）5μl

   
   

4. NaCl 100 mM（終濃度）

   
   

5. Tris‐Cl pH7.4 50 mM（終濃度）

   
   

6. 加水補(bǔ)足 50 μl

   
   

7. 將配制好的退火反應(yīng)緩沖液重復(fù)混合，短暫離心后放置 PCR 儀上，運(yùn)行以下程序： 90℃ 4 min， 70℃ 10 min， 55℃ 10 min， 40℃ 10 min， 25℃ 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在 ‐20℃ 長(zhǎng)期保存。

用 EcoRV 酶切 2 μg pCas9/gRNA 載體（inovogen）。通常情況下用大約 20～30 單位的酶大約 3 小時(shí)可以酶切完全。酶切后我們建議用瓊脂糖凝膠回收線性化載體。將回收后的線性化載體定量，通常線性化載體的工作濃度為 50～100ng/μl。連接用水將退火后雙鏈寡核苷酸 (10 μM) 稀釋 100 倍備用。

連接反應(yīng)體系：

T4 DNA 連接酶 5U

EcoRV 5U

線性化載體 2 μl

稀釋 100 倍后雙鏈寡核苷酸 1 μl

10× 連接酶 Buffer 1 μl

50% PEG4000 1 μl

加水補(bǔ)足 10 μl

反應(yīng)條件： 22℃ 30 min， 37℃ 15 min。

注：

1. 平末端連接效率較低，在連接體系中添加 PEG4000 可以提高連接效率。

   
   

2. 在連接體系中添加 EcoRV 酶可以顯著提高陽(yáng)性率。

挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證, 驗(yàn)證正確后, 提取質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn), 關(guān)于 sgRNA 是否有效。可以轉(zhuǎn)染之后，直接提取 DNA，通過測(cè)序驗(yàn)證，如果在靶標(biāo)位點(diǎn)附近開始出現(xiàn)雜亂的多峰說明是 sgRNA 有效，如果沒有則該 sgRNA 無效。