4月15日，隸屬于麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的世界著名生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)Broad研究所宣布，美國(guó)專利局批準(zhǔn)了由他們所申請(qǐng)的基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)專利。這是目前世界第一例獲得專利保護(hù)的基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)。

正在生物體內(nèi)發(fā)揮功能的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。插畫家：Stephen Dixon

所謂基因編輯技術(shù)，是指對(duì)DNA核苷酸序列進(jìn)行刪除和插入等操作，換句話說(shuō)，基因編輯技術(shù)使得人們可以依靠自己的意愿改寫DNA這本由脫氧核苷酸寫而成的生命之書。然而長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)DNA的編輯只能通過(guò)物理和化學(xué)誘變、同源重組等方式來(lái)對(duì)DNA進(jìn)行編輯。然而這些方法要么編輯位置隨機(jī)，要么需要花費(fèi)大量人力物力進(jìn)行操作。因此，能夠方便而精確的對(duì)DNA和核苷酸序列進(jìn)行編輯，是科研工作者們長(zhǎng)期以來(lái)的夢(mèng)想。CRISPR-Cas9系統(tǒng)的誕生和成熟標(biāo)志這這一夢(mèng)想逐漸變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。此外不僅僅在科研界，在諸如醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等研究中，這一技術(shù)也顯現(xiàn)除了巨大的應(yīng)用前景。因此，這一技術(shù)獲得專利，是該技術(shù)走向應(yīng)用的里程碑式事件。

從細(xì)菌免疫系統(tǒng)到DNA編輯工具

CRISPR-Cas9系統(tǒng)并非天生就是為人類使用而產(chǎn)生的。它的本質(zhì)其實(shí)是細(xì)菌中一種對(duì)付諸如病毒等外來(lái)DNA的防御系統(tǒng)。在一些細(xì)菌基因組中存在一系列成簇排列的DNA序列，被稱作“規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。這些重復(fù)序列的間隔序列，被發(fā)現(xiàn)和很多能夠侵入細(xì)菌的噬菌體DNA序列相同。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些序列在被轉(zhuǎn)錄成為RNA后，能夠和細(xì)菌產(chǎn)生的一類稱為Cas的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，來(lái)對(duì)Cas蛋白起到導(dǎo)向作用，因此這段RNA也被稱為導(dǎo)向RNA（guide RNA，gRNA）。當(dāng)復(fù)合體檢測(cè)到入侵的DNA和gRNA序列一致時(shí)，Cas蛋白就能夠切割入侵的DNA，達(dá)到防御的目的。

注：嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，在細(xì)菌體內(nèi)gRNA由兩部分組成：一部分為活化Cas蛋白所需的tracrRNA，另一部分為來(lái)自于間隔區(qū)、識(shí)別入侵DNA的crRNA。在人工構(gòu)建的CRISPR-Cas9系統(tǒng)載體中，這兩段RNA可融合為一條。

CRISPR-Cas系統(tǒng)這種序列特異性的DNA切割機(jī)制很快引起了人們的興趣。由于這一系統(tǒng)能夠切割DNA，并且其序列特異性由crRNA的序列所決定，因此它成為了DNA編輯的理想工具。細(xì)菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)極為多樣，而一個(gè)來(lái)自產(chǎn)膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的由Cas9蛋白參與的系統(tǒng)被人們研究的最為透徹。因此人們對(duì)它進(jìn)行了改造，將編碼Cas9蛋白的序列及其附屬元件共同制造成為一個(gè)單一的載體。同時(shí)為了能夠讓這些組分進(jìn)入真核細(xì)胞的細(xì)胞核，還加入了入核信號(hào)元件。這樣一來(lái)，只要科研人員只需針對(duì)需要編輯的DNA序列合成一段DNA序列，插入這個(gè)載體的特定部位。在轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，產(chǎn)生的人工構(gòu)建的gRNA就能指導(dǎo)Cas9蛋白切割宿主細(xì)胞特定的DNA序列，從而起到基因編輯的作用。

CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)示意。圖片來(lái)源：《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》

DNA編輯的廣泛前景

CRISPR-Cas9系統(tǒng)，被稱為第三代基因編輯技術(shù)。相比于它的兩位前輩ZFN系統(tǒng)和TALEN系統(tǒng)，它有著一些無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。首先，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的可用位置更多。理論上基因組中每8個(gè)堿基就能找到一個(gè)可以用CRISPR-Cas9進(jìn)行編輯的位置，可以說(shuō)這一技術(shù)能對(duì)任一基因進(jìn)行操作，而TALEN和ZFN系統(tǒng)則在數(shù)百甚至上千個(gè)堿基中才能找到一個(gè)可用位點(diǎn)，這大大限制了使用范圍。其次，CRISPR-Cas9系統(tǒng)更具有可拓展性，例如可以通過(guò)對(duì)Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈，而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈后帶來(lái)的非同源末端連接造成的染色體變異風(fēng)險(xiǎn)。此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，來(lái)在特定DNA序列上研究這些蛋白對(duì)細(xì)胞的影響。第三，更為重要的是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的使用極為方便，只需要簡(jiǎn)單的幾步就能完成，幾乎任何實(shí)驗(yàn)室都可以開展工作，而不需要向ZFN和TALEN那樣借助商業(yè)公司的協(xié)助完成。由于以上特點(diǎn)，CRISPR-Cas9被評(píng)為2013年生物學(xué)10大突破之一。值得說(shuō)明的是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在真核細(xì)胞中很多重要的研究，都是由華人學(xué)者張峰主持完成的。

由于來(lái)源于細(xì)菌的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在真核細(xì)胞內(nèi)也能很好的工作，這顯示出了其巨大的應(yīng)用潛力。例如在基礎(chǔ)科學(xué)研究領(lǐng)域，CRISPR-Cas9系統(tǒng)最多的是被用來(lái)定點(diǎn)敲除一些基因，從而便于研究這些基因的生物學(xué)功能。同時(shí)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的商業(yè)化應(yīng)用潛力也不容小視。例如在生物治療領(lǐng)域，結(jié)合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）技術(shù)，人們可以將通過(guò)基因編輯修復(fù)的iPS細(xì)胞重新發(fā)育為正常組織和器官來(lái)供病人使用。而在家畜育種等工作中，對(duì)一些關(guān)鍵性狀基因的編輯能夠大大加快良種的育種速度。

正是由于CRISPR-Cas9的諸多優(yōu)秀特點(diǎn)和廣泛的應(yīng)用前景，因此它成為了專利申請(qǐng)的熱門方面。盡管已經(jīng)有多份應(yīng)用CRISPR序列或Cas蛋白的技術(shù)專利，但這次Broad研究所獲得批準(zhǔn)的是第一份將一整套CRISPR-Cas9系統(tǒng)載體和操作方法包括在內(nèi)的專利。這意味著今后使用這一技術(shù)進(jìn)行基因編輯操作都將涉及這份專利所保護(hù)的內(nèi)容。那么，專利的批準(zhǔn)是否會(huì)妨礙這一技術(shù)的使用呢？目前來(lái)看，基礎(chǔ)研究受到影響的可能性不大，因?yàn)锽road研究院的主任埃里克·蘭德（Eric Lander）在專利宣布的新聞稿中表示：“考慮到Broad研究所的使命是為了加速我們對(duì)于疾病的理解和治療，因此我們承諾授權(quán)給全球的研究團(tuán)隊(duì)使用這種技術(shù)的權(quán)利?！钡牵诟欣蓤D的商業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域，這一專利的出現(xiàn)是否會(huì)對(duì)使用該技術(shù)的企業(yè)造成影響還有待觀察，畢竟Broad研究所在上述表態(tài)之外還有一句：“享有這一專利的限制權(quán)”。

參考資料

1. The Scientist: Patent Covers CRISPR
2. United States Patent: CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
3. Zhang F et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. (2013) Science 339(6121): 819-823